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水稻黄单胞菌水稻致病变种与致病相关的新基因的功能鉴定

梁莹  
【摘要】:作者所在实验室以前工作表明含有水稻黄单胞菌水稻致病变种(以下简称Xoo)13751 DNA的重组质粒pGXN3000上至少有4个基因(rpfA、rpfB、rpfC、rpfF)能正向调控该菌的胞外多糖的产生及致病性并已完成了pGXN3000的序列测定。序列分析表明pGXN3000的rpfA上游有4个完整的ORFs,分别为pdeA、cheB、pin、pcaD。pdeA基因为2262 bp,可编码一个含754个氨基酸的产物,该产物与地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(以下简称Xac)的环二鸟苷酸磷酸二酯酶A(c-di-GMP phosphodiesterase A)有96%的相似性和93%的相同性。cheB基因为1074 bp,可编码一个含358个氨基酸的产物,该产物与Xac的谷氨酸甲酯酶(glutamate methylesterase)的相似性和相同性均为67%。pcaD基因为813bp,可编码一个含271个氨基酸的产物,该产物与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(以下简称Xcc)的β-酮已二烯醇内酯水解酶(beta-ketoadipate enol-lactone hydrolase)有92%的相似性和85%的相同性。pin基因产物的功能域分析表明其第189-198个氨基酸为锌指结合域(zinc finger binding domain,ZnF_NFX域)。在rpfC基因下游有—ORF的产物与Xcc的属于双组分调控系统家族的调节蛋白RpfG有99%的相似性和96%的相同性。 为了了解Xoo pdeA、rpfG、cheB、pin、pcaD基因在该菌在水稻致病过 广西大学硕_l:学位论文 程中的作用和功能,我们用同源自杀质粒单位点整合突变方法分别构建得到 了该菌的p认纳一突变体(GXNI 256)、,月一突变体(GXNI 258)、CheB一突变体 (GXNI 255)、刀j厅突变体(GXN1269)和户eal)一突变体(GXN1261)。 水稻植株剪叶接种试验表明,xo口p/n-突变体GXNI 269在水稻上引起 的病斑长度与野生型13751的没有显著差别,说明xo口pl’n基因可能与其在 水稻上的致病性无关。无论是在高接种浓度(OD600二0.1)还是在低接种浓度 (0D600=0.001)下,而oFp几一突变体GXNI 258、p动纳一突变体GXNI 256和pCaD- 突变体GXNI 261在水稻上引起的病斑长度显著降低,在高接种浓度(OD600= 0.1)下,GXNI 25a、GxNI 256和GxNI 261在水稻上引起的病斑长度分别是野 生型13751的21.37%、64.69%和77.44%,在低接种浓度(0D600=0.001)下 则分别是野生型13751的14.47%、67.99%和76.10%,说明而。的rP招、刀决斌 和pCao基因与其在水稻上的致病性有关。 平板检测表明xo口p丈介绒一突变体GXNI 256、rP招一突变体GXNI 258的胞外多 糖和OSF因子的产量均显著减少,说明xo口胞外多糖和OSF因子的产生与rP招 和p尤论斌基因有关。xo口pde月基因产物的功能域分析表明其第317一488个氨基 酸为具有环二鸟昔酸磷酸二醋酶A活性的OUFI域和第498一745个氨基酸为具 有二鸟昔酸环化酶活性的DU「2域(也称GGOE「基序),这两个酶可能参与调 控细胞内信号分子环二鸟昔酸的浓度。xo口rP凡基因产物的功能域分析表明 第1 92一329个氨基酸为HD域,属于依赖金属的磷酸水解酶家族。关于信号分 子环二鸟昔酸与病原菌在植物上的致病的相关性目前还未见报道。平板检测 表明xo口p决流基因能很好地恢复rP绍一突变体GxNI 258产Ds「的能力,xo口rP凡 基因也能很好地恢复pdeA一突变体GXN 1 256产胞外多糖和DSF的能力。 广西大学硕士学位论文 水稻植株剪叶接种试验表明cheB一突变体GXN 1 255在水稻上引起的病斑长 度与13751的没有显著差异,但是水稻植株喷雾接种试验表明cheB一突变体 GXN 1 255在水稻上引起的病情指数是1 3751的48.91%。毛细管趋化应答试验 表明ch出一突变体的趋化能力显著降低,说明cheB基因与xo口的趋化应答有 关,xo。的ch出基因与其在水稻上的致病性有关可能是通过控制其趋向水孔 有关。进一步说明趋化性可能在植物病原细菌致病的早期起重要作用。


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