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《广西大学》 2007年
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广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选研究

韦信贤  
【摘要】: 马立克氏病(MD)是鸡的一种恶性T淋巴细胞增生性疾病,对养禽业危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关分子遗传学标记的筛选研究,旨在确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作,以弥补目前依赖疫苗免疫和生物安全为主的MD防制手段的不足。至此,已完成如下主要工作: 利用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法,对120份霞烟鸡B-L BⅡ基因第2外显子的PCR扩增产物采用限制性内切酶AluⅠ、CaiⅠ、CfrⅠ、HinlⅠ、HinfⅠ和RsaⅠ分别进行分析。运用在这6个位点所观测的纯合基因型组合对B-L BⅡ等位基因纯合型鸡只进行初步筛选,并通过进一步的克隆、测序,最终获得B-L BⅡ等位基因纯合型鸡只7羽(其中MD抗性个体5羽,代号分别为:A_(11)、C_(23)、D_8、D_(12)、K_8;易感个体2羽,代号分别为:A_5、B_(21))。所获得7羽霞烟鸡的序列经与GenBank下载的B~2、B~6、B~(12)、B~(19)、B~(21)单倍型B-L BⅡ基因的序列相比较,发现此基因区域碱基替代非常频繁,呈现出丰富的多态性。MD抗性个体A_(11)、C_(23)、D_(12)、K_8间的核苷酸同源性达100%,与B~6单倍型(中等MD抗性型)核苷酸和氨基酸同源性较高,分别达到98.9%和97.8%;这4羽霞烟鸡在MDV攻毒实验中均具有明显的MD抗性。MD易感个体A_5、B_(21)间的核甘酸同源性达95.5%,与B~(19)单倍型(MD易感型)核苷酸同源性分别达96.3%和94.8%,氨基酸同源性分别达91.0%和89.9%;这2羽霞烟鸡在MDV攻毒实验中均表现出易感性。MD抗性个体A_(11)、C_(23)、D_(12)、K_8与易感个体A_5、B_(21)的核苷酸同源性仅分别为91.4%和93.3%,氨基酸同源性仅分别为83.1%和85.4%,存在较大的差异。因此,推测MD抗性个体A_(11)、C_(23)、D_(12)、K_8的B-L BⅡ基因序列为具有MD抗性的一个特征序列;MD抗性个体D_8的B-L BⅡ基因序列虽与A_(11)等抗性个体的核苷酸同源性较低,但在MDV攻毒实验中表现出明显的MD抗性,故推测D_8的B-L BⅡ基因序列为具有MD抗性的另一特征序列。而MD易感个体A_5、B_(21)的B-L BⅡ基因序列则推测为两个MD易感的特征序列。 应用建立的逆转录酶—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对霞烟鸡GH基因转录子进行扩增,并对目的基因进行TA克隆,经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,将目的基因片段成功定向亚克隆于pSP72质粒T7启动子下游的多克隆位点,经PCR和HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,采用HindⅢ单酶切pSP72-GH重组质粒得到线性化转录模板DNA,在体外以T7 RNA聚合酶转录合成,成功制备用于进行核糖核酸酶保护实验(RPA)的GH反义RNA探针;采用核糖核酸酶保护技术对MD抗性与易感霞烟鸡个体进行GH基因的mRNA定量表达测定,结果显示MD抗性个体的GH基因表达水平比易感个体低,且二者之间存在明显差异,从而可以初步的把GH基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记之一。 应用逆转录酶—聚合酶链式反应(RT-PCR)逆转录扩增GH基因、B-F基因和GAPDH基因转录子的cDNA,并将纯化的cDNA亚克隆于pGM-T载体的多克隆位点。重组质粒DNA经PCR和HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定及测序分析,证实GH基因、B-F基因和GAPDH基因成功重组到pGM-T载体上。将梯度浓度的GH基因、B-F基因和GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR,建立标准曲线。经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都到达10拷贝/反应。结果表明,实时荧光定量PCR检测GH基因、B-F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线构建成功。 本研究的结果表明,MD抗性鸡与易感鸡间的B-L BⅡ基因序列存在明显的差异;MD抗性鸡与易感鸡在GH基因的表达水平上亦存在明显差异。因此,可以初步的把B-L BⅡ基因和GH基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记。此外,本研究还成功构建了实时荧光定量PCR检测GH基因、B-F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线,为下一步定量检测GH基因和B-F基因在不同MD抗性能力霞烟鸡外周血淋巴白细胞的表达水平奠定了基础。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S831

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