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利用微生物生产胆固醇氧化酶的研究

王发合  
【摘要】: 胆固醇氧化酶是胆固醇代谢的关键酶之一,它催化胆固醇氧化及异构化反应,生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢。胆固醇氧化酶被广泛应用于临床诊断、制药工业、食品加工及生物农药等方面,具有广泛的应用前景。 本研究通过紫外+LiCl、紫外+光敏试剂处理类芽孢杆菌X534,筛选出一株酶活较高的诱变菌株XUM10,酶活为221.20 U.L~(-1),比出发菌株提高了近2.5倍。 此外对发酵工艺进行了改变,首先对突变株产酶条件进行了优化,确定了合适的产酶培养基及其组成,并对发酵温度、溶氧、pH等进行优化。在温度30℃,pH值为8,转速200r/min,摇瓶发酵50h,发酵液酶活达到275.41 U.L~(-1)。 通过旋转蒸发浓缩、蔗糖浓缩、DEAE离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析对该酶进行纯化,纯化后的浓缩酶液的酶活力达到6.83U/mg。通过SDS-PAGE电泳,测定酶的分子量为58KDa,以胆固醇为底物的米氏常数3.3×1O~(-5)mol/L,最大反应速度为4.60mmol/(L·min),显示了与底物良好的亲和性,从薄板层析结果看,转化产物单一,为有药用价值的胆甾-4-烯-3-酮。 比较多种固定化酶的方法,最终确定固定化酶的材料为PVA+H_3BO_3+Na_2CO_3。并确定固定化酶最适温度为60℃,最适pH为7.0,其热稳定性及pH稳定性相对与游离酶有了很大程度的提高,通过电镜扫描观察固定化内部为小而密的多孔网状结构,使酶液很好的包埋在固定化材料内。通过固定化酶对牛奶中胆固醇的转化率试验,可知最高转化率为75.64%。


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