收藏本站
《广西大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、表达及产物的酶学特性研究

封毅  
【摘要】: 全世界的石油资源已经面临枯竭的危险,许多国家正在努力寻找可以替代石油的可再生能源。燃料乙醇是车用汽油的替代燃料,大力开发和使用燃料乙醇对能源危机的缓解,环境的保护,经济的可持续发展、农民收入的增加以及国家的安全都有着重大的意义。目前生产燃料乙醇的主要原料为淀粉类和糖质类。木质纤维素是植物利用太阳能合成的由葡萄糖聚合而成的多糖,是世界上最丰富的、可再生的生物质资源。纤维素可以在纤维素酶的作用下被降解成为葡萄糖,葡萄糖很容易在微生物的作用下发酵生成乙醇,所以,木质纤维素是最有发展潜力的燃料乙醇的生产原料。但由于目前的纤维素酶普遍存在着酶活力低、生产成本高的缺陷,用木质纤维素生产燃料乙醇至今不能真正实现工业化,开发新的纤维素酶资源一直是该领域的研究热点。 自然界中,纤维素酶主要由微生物产生,草食动物依靠消化道中的微生物来分解富含纤维素的食物。盲肠是兔子等非反刍草食动物最重要的消化器官,盲肠中许多共生微生物能分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等降解植物的细胞壁。但是,迄今为止,国内外还没有从兔子盲肠中克隆到纤维素酶基因的研究报道。本文通过未培养的方法,从兔子盲肠内含物中克隆细菌的纤维素酶基因,研究兔子盲肠中纤维素酶的多样性以及它们的生化特性,为进一步挖掘兔子盲肠纤维素酶的应用潜力奠定基础。 在本研究中,我们直接提取兔子盲肠内含物中微生物的混合DNA(宏基因组DNA),扩增了宏基因组DNA的16S rRNA基因,通过遗传进化分析发现,样品中大部分细菌是未研究过的细菌,它们主要来源于厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)及拟杆菌门(Bacteroidetes)。 我们用提取到的混合DNA构建了一个兔子盲肠未培养微生物的宏基因组柯斯质粒文库,文库含3.25×10~4个克隆,平均插入片段为35.1kb,文库总容量为1.14×10~9bp,文库的外源插入片段具有很好的随机性。 我们对文库进行活性筛选,获得了11个表达纤维素酶活性的独立克隆,其中有4个克隆表达内切-β-1,4-D-葡聚糖酶和7个克隆表达β-葡萄糖苷酶活性。对这11个独立克隆分别进行了亚克隆和测序分析,所得到的11个纤维素酶基因与GenBank中已知的纤维素酶基因在核苷酸水平上没有明显的同源性,它们的编码产物与已知的纤维素酶的氨基酸一致性低于50%、相似性低于70%,说明本研究所克隆到的纤维素酶基因均为新的基因。由此可见,兔子盲肠是研究和发现新的纤维素酶基因的很好材料。从氨基酸序列分析得知,4个内切-β-1,4-D-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第5家族(Glycosyl hydrolase family 5),它们都只含有一个糖基水解酶第5家族的催化功能域(Cellulase domain),而不含碳水化合物结合组件(Carbohydrate-binding module)。7个β-葡萄糖苷酶均属于糖基水解酶第3家族,它们肽链的N端均含有糖基水解酶3C功能域(Glycosyl hydrolase family 3 C-terminal domain),C端均含有糖基水解酶3功能域(Glycosyl hydrolase family 3 domain)。 对11个纤维素酶阳性克隆所表达的粗酶进行了初步的酶学特性分析,其中10个纤维素酶的最适作用pH和温度分别为pH5.5~7.0和40~55℃,与兔子盲肠内的pH和温度(pH6.5和39℃)相似,说明所克隆到的纤维素酶较好地适应了兔子盲肠的内部环境。4个内切-β-1,4-D-葡聚糖酶具有广泛的底物范围,它们都能降解以β-1,3/1,6键合的葡聚糖——昆布多糖(Laminarin),这一性质在第5家族的内切葡聚糖酶中非常特别。 我们用大肠杆菌BL21(DE3)过量表达了一个内切葡聚糖酶基因umcel5G和一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3B,纯化了表达产物,对纯化的重组酶进行了酶学性质研究。 纯化后的重组内切-β-1,4-D-葡聚糖酶Umcel5G在pH5.0~9.0和温度低于55℃的条件下比较稳定,其最适作用条件为:pH6.0~6.5和55℃。该酶以随机内切的方式作用于纤维寡糖,CoCl_2、CaCl_2和CrCl_2对该酶有激活作用,而CuCl_2、ZnCl_2、螯合剂EDTA和表面活性剂SDS对该酶有抑制作用。Umcel5G对CMC底物的Km值为16.07mg/ml,最大反应速度Vmax为417.5U/mg。 纯化后的重组β-葡萄糖苷酶Umbgl3B在pH4.5~9.0和温度低于35℃的条件下比较稳定,其最适作用条件为:pH6.0~7.0和40℃。Umbgl3B能降解纤维二糖,对三糖以上的纤维寡糖没有作用,是个典型的β-葡萄糖苷酶。COCl_2和CrCl_2对该酶有较强的激活作用,CuCl_2、EDTA和SDS则显著降低该酶的活力。 在本课题的研究中,我们在国际上首次采用未培养方法从兔子盲肠中克隆纤维素酶基因,阐述了兔子盲肠纤维素酶的多样性,首次异源表达了克隆自兔子盲肠未培养微生物的一个内切-β-1,4-D-葡聚糖酶基因和一个β-葡萄糖苷酶基因,并较为深入地研究了这两个纤维素酶的酶学特性。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

手机知网App
【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 杨伟平;藏猪肠道细菌群落组成与纤维素分解菌的研究[D];西北农林科技大学;2015年
2 陆坚;利用宏基因组技术克隆和鉴定高糖土壤中与糖类水解相关酶类的基因[D];广西大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 霍云龙;Paenibacillus cookii GX-4的β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达、酶学性质研究与分子改造[D];广西大学;2013年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 许跃强;段承杰;周权能;唐纪良;冯家勋;庞浩;封毅;莫新春;郭鸿;张鹏;;造纸废水纸浆沉淀物中未培养微生物纤维素酶基因的克隆和鉴定[J];微生物学报;2006年05期
2 何冠明;何国正;;石油资源和能源可持续发展战略问题探析[J];国际石油经济;2006年08期
3 瞿国华;;新世纪中国石油资源风险分析[J];当代石油石化;2006年04期
4 赵广存,段承杰,庞浩,封毅,许跃强,莫新春,唐纪良,冯家勋;牛瘤胃未培养细菌中一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3A的克隆及鉴定[J];西南农业学报;2005年04期
5 高培基;纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展[J];自然科学进展;2003年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张玉明;;凝结芽孢杆菌在乳酸生物炼制中的应用[J];中国酿造;2017年02期
2 王敏;陈娜;冯骏;井申荣;;筛选最佳生物质材料诱导里氏木霉生产纤维素酶[J];基因组学与应用生物学;2015年12期
3 曾俊棋;岳万福;;添加麸皮与纤维素酶对笋壳青贮后氰甙含量的影响[J];安徽农业科学;2015年32期
4 王少昆;赵学勇;黄文达;李玉强;岳祥飞;张腊梅;;科尔沁沙质草地纤维素分解菌的筛选、鉴定及其分解能力[J];中国沙漠;2015年06期
5 贾富国;史宇菲;韩燕龙;王会;姚丽娜;曾勇;蒋龙伟;张强;;非浸泡复合酶法预处理改善糙米碾米性能[J];农业工程学报;2015年16期
6 于跃;张剑;何德志;;纤维素酶活力测定条件研究及其在洗涤剂中的应用[J];日用化学工业;2015年08期
7 高静思;孙岩斌;文雪;王玮;刘研萍;;NaOH预处理对秸秆高固体浓度酶水解效果影响[J];中国沼气;2015年03期
8 张俊;赵圣国;王加启;金迪;卜登攀;;利用元基因组学方法从瘤胃中筛选的功能酶及酶基因研究进展[J];生物技术通报;2015年05期
9 赵联正;谢占玲;贾贤卿;;镰刀菌Q7-31T菌株植物细胞壁降解酶系的结构[J];贵州农业科学;2015年05期
10 曹军卫;高志;凌定元;王健;;生物技术在能源领域中的应用与发展前景[J];山东化工;2015年07期
【同被引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 胡远亮;利用分子生物技术研究益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响[D];华中农业大学;2014年
2 王永霞;云南高原程海湖沉积物中的细菌多样性研究[D];云南大学;2014年
3 司春灿;基于丛枝菌根真菌共生的外来植物南美蟛蜞菊入侵机理研究[D];江苏大学;2014年
4 彭虹旎;短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus 4D-14)的分离与分子鉴定,抑菌性及微生态制剂应用研究[D];中国海洋大学;2013年
5 任大勇;益生乳酸杆菌的黏附及免疫调节作用研究[D];吉林大学;2013年
6 兰天晴;固定细胞发酵产纤维素酶及纤维素乙醇的生产应用研究[D];华南理工大学;2013年
7 董晓丽;益生菌的筛选鉴定及其对断奶仔猪、犊牛生长和消化道微生物的影响[D];中国农业科学院;2013年
8 安小鹏;山羊产羔性状候选基因的筛选及其多基因聚合效应的研究[D];西北农林科技大学;2013年
9 李旺;纤维素酶基因重组野生型乳酸杆菌表达系统的构建[D];西北农林科技大学;2010年
10 赵述淼;猪源益生芽孢杆菌的分离筛选与应用研究[D];华中农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张丽萍;红树林土壤宏基因组文库中新型β-葡萄糖苷酶的筛选及其酶学性质研究[D];中山大学;2012年
【二级引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 勾长龙;抗生素对肉鸡脂肪沉积的影响及其机理研究[D];吉林农业大学;2018年
2 邓玉营;共培养菌群强化秸秆厌氧消化及微生物学机制研究[D];江南大学;2017年
3 辛海云;藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究[D];西北农林科技大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 杨芯卓;嗜热微生物来源的葡萄糖苷酶和木糖苷酶性质及功能研究[D];中国农业科学院;2014年
2 裴佩;热荚硫细菌UDP-葡萄糖4-差向异构酶的基因克隆、表达及酶学性质研究[D];扬州大学;2014年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 高巍,孟庆翔;瘤胃细菌、原虫和真菌降解植物细胞壁的相对贡献及其互作[J];中国农业大学学报;2003年05期
2 杨金焕;太阳能发电的进展及建议[J];世界科技研究与发展;2003年04期
3 张文祥,林胜勇,赵金才;月球探测技术——发展历程和特点[J];上海航天;2003年03期
4 蓝贤勇,陈宏,张润锋,田燚;瘤胃微生物纤维素酶的研究与应用前景[J];黄牛杂志;2003年02期
5 陈庆今,刘焕彬,胡勇有;瘤胃微生物对纤维素降解机理[J];微生物学杂志;2002年02期
6 黄峰,方靖,卢雪梅,高培基,陈嘉翔;纤维二糖脱氢酶对锰过氧化物酶降解木素的促进作用[J];科学通报;2001年18期
7 陈冠军,杜娟,庄蕾,高培基;脱墨用棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中内切酶的纯化及性质[J];微生物学报;2001年04期
8 邱励俭;核聚变研究50年[J];核科学与工程;2001年01期
9 汪天虹,邹玉霞,石屹峰,高培基,刘佶,吴静;微紫青霉CBHⅠ酶纤维素结合结构域在大肠杆菌中的分泌型表达及性质研究[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年05期
10 黄峰,高培基,陈嘉翔;应用循环式液-液萃取法分离及鉴定木素生物降解物质[J];中国科学E辑:技术科学;2000年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李光燮;李革;李林虎;;移动盲肠143例临床分析[J];延边大学医学学报;2008年03期
2 张心如,罗宜熟,杜干英,张正贤,张炜;兔盲肠解剖生理学特点与消化道疾病[J];中国养兔;2003年02期
3 栾德强,丁煦超;移动盲肠综合征29例误诊分析[J];实用乡村医生杂志;2001年02期
4 屠声荣,宋华;盲肠、阑尾位于腹下区一例[J];贵阳中医学院学报;2001年04期
5 胡振武,胡圣望,黄朝雁;高位盲肠、阑尾1例[J];咸宁医学院学报;2001年01期
6 黄淑兰,杜玉生,张庚扬,赵昌愿;移动盲肠症40例临床分析[J];中国中西医结合外科杂志;2000年01期
7 何政训,唐俊,秦虎;超长阑尾缠绕盲肠一例报道[J];腹部外科;1999年04期
8 费三弟;乳牛盲肠积食、膨气的诊断与手术治疗[J];上海农业科技;1999年05期
9 邓焕辰,郑洪证,吴积培;移动盲肠症9例报告[J];福建医药杂志;1995年01期
10 苗华,于光生,严麟书,秦登友,邵正仁,李秀娟;小儿盲肠和阑尾的年龄解剖学研究[J];四川解剖学杂志;1995年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 黄燕华;冯定远;;不同纤维素酶对鹅盲肠微生态及水解碳水化合物酶类的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
2 林琳;江斌;吴胜会;张世忠;;鸭盲肠杯叶吸虫病的人工感染试验[A];2012年福建省畜牧兽医学术年会论文集[C];2012年
3 周昌芳;谢光洪;李英俊;;手术根治奶牛复发性盲肠变位1例[A];全国兽医外科学第13次学术研讨会、小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会论文集[C];2006年
4 邹芙沁;文斌;孙豪;周毅;曾东;倪学勤;汪平;杨明月;;杆菌肽锌对断奶獭兔盲肠菌群和免疫功能的影响[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集[C];2016年
5 张亚南;余凯凡;朱伟云;;盲肠短时灌注丙酸钠对生长猪采食的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集[C];2016年
6 潘庆山;张健;董军;;罕见盲肠反转、结肠套叠病例[A];全国兽医外科学第13次学术研讨会、小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会论文集[C];2006年
7 封毅;段承杰;庞浩;许跃强;张鹏;莫新春;吴春凤;唐纪良;冯家勋;;兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定、表达以及表达产物的酶学特性研究[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年
8 蒋银屏;王志跃;杨海明;周春江;;去盲肠鹅和未去盲肠鹅测定饲料氨基酸消化率的研究[A];中国畜牧兽医学会家禽学分会第九次代表会议暨第十六次全国家禽学术讨论会论文集[C];2013年
9 王健;王志跃;赵万里;陈伟亮;;正常及去盲肠鹅对不同纤维日粮蛋白质、钙、磷代谢率的比较[A];家禽研究最新进展——第十一次全国家禽学术讨论会论文集[C];2003年
10 陈慧子;余凯凡;朱伟云;;盲肠灌注丙酸钠对生长猪机体代谢的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集[C];2016年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张继泉;盲肠·阑尾·阑尾炎[N];民族医药报;2001年
2 朗图设计创始人 深圳市平面设计协会副会长 冯志锋;深圳的盲肠[N];21世纪经济报道;2010年
3 张继泉;盲肠·阑尾·阑尾炎[N];医药经济报;2001年
4 本报记者 林纯洁;瑞富“风险提示”,谁的盲点或盲肠?[N];第一财经日报;2005年
5 ;兔盲肠的消化特点[N];中国畜牧兽医报;2008年
6 李国中;海口“城市盲肠”如何新生[N];中国图书商报;2007年
7 向南方;切除文牍主义这一“盲肠”[N];解放军报;2015年
8 ;盲肠球虫与小肠球虫并发[N];中国畜牧兽医报;2008年
9 辽宁营口市中心医院退休主任医师 秦克义;术中如何找阑尾[N];健康报;2008年
10 本报记者 卢天娇 实习生 陈璐;厦门将告别50年的铁路“盲肠尾” [N];厦门日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 封毅;兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、表达及产物的酶学特性研究[D];广西大学;2007年
2 邓文;地衣芽孢杆菌缓解蛋鸡热应激的效果及机理研究[D];中国农业科学院;2011年
3 梅绍锋;高铜对断奶仔猪的促生长和微生态效应研究[D];四川农业大学;2009年
4 张莹;牛瘤胃与马盲肠内微生物降解硝基毒素的特性与机理研究[D];兰州大学;2014年
5 张亚波;嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造[D];山东农业大学;2009年
6 周海柱;鹅肠道菌群对日粮纤维响应规律及其功能研究[D];吉林农业大学;2016年
7 杨伟平;藏猪肠道细菌群落组成与纤维素分解菌的研究[D];西北农林科技大学;2015年
8 周维仁;兔日粮尿素氮利用机理及其应用[D];南京农业大学;2004年
9 李勇昊;利用可溶性诱导物批式流加发酵培养里氏木霉生产纤维素酶[D];大连理工大学;2017年
10 张飞;利用人工锌指蛋白技术提高里氏木霉Rut-C30纤维素酶产量[D];大连理工大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 金光玉;低位盲肠(或盲肠下垂)的影像学诊断及其临床价值的研究[D];延边大学;2002年
2 蒋银屏;去盲肠对鹅饲料养分利用率的影响[D];扬州大学;2013年
3 周建波;利用扩增核糖体基因限制性分析法研究竹鼠盲肠细菌多样性[D];广西大学;2012年
4 孙玲红;鹅盲肠产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学性质研究[D];安徽农业大学;2016年
5 史永军;去盲肠及两种内源氨基酸校正方法对鹅饲料氨基酸消化率测定影响的研究[D];扬州大学;2006年
6 张进;铜和汞对小鼠盲肠、直肠微生物多样性的影响[D];江西农业大学;2017年
7 谢燕娟;低粗纤维饲粮对仔鹅生长发育及盲肠微生物的影响[D];扬州大学;2016年
8 金月平;非麻醉肠镜盲肠到达率和进镜时间相关因素的分析[D];苏州大学;2015年
9 张集建;胃大部切除带蒂回盲肠间置幽门替代手术的实验研究[D];第三军医大学;2005年
10 刘晓娟;不同纤维源日粮对吉林白鹅消化生理及盲肠发酵的影响[D];吉林农业大学;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026