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菜粉蝶颗粒体病毒的分子生物学研究

温荣辉  
【摘要】: 菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae granulovirus,PiraGV)属于杆状病毒科(Baculoviridae)颗粒体病毒属(granulovirus genus)的一个成员。PiraGV在自然状况下仅感染菜粉蝶(Pieris rapae),是控制菜粉蝶种群数量和维持生态平衡的重要生物因素之一。虽然PiraGV作为一种病毒性杀虫剂用于菜粉蝶的防治已有多年历史,但关于PiraGV的研究主要集中在生物学方面,有关PiraGV的分子生物学研究非常有限。本论文对PiraGV进行了分子生物学方面的研究,包括以下几个方面: 1.PiraGV的形态学、致病力和克隆纯化:从采自田间的具有颗粒体病毒感染症状的自然罹病死亡的菜粉蝶幼虫体内分离到病毒包含体样颗粒,在透射电镜下观察到典型的颗粒体病毒形态结构特征;接种实验显示分离到的病毒具有很强的感染性,被感染的菜粉蝶幼虫呈现典型的颗粒体病毒感染症状。经三次连续的菜粉蝶幼虫体内克隆,获得了限制性内切酶片段同质的病毒基因型PiraGV-E3。 2.PiraGV-E3基因组物理图谱构建:经限制性内切酶EcoRⅠ,SaiⅠ,HindⅢ和KpnⅠ酶切分别产生了17、23、14、14个酶切片段,各酶切片段被回收并克隆,构建了包含4种酶切片段的PiraGV-E3基因组质粒文库。文库中的质粒经单酶切或双酶切以及质粒两端的测序,各酶切片段在基因组中的相对位置被确定,最后构建了包含4种限制性内切酶位点的PiraGV-E3基因组的物理图谱。该物理图谱与已报道的其他的PiraGV分离株的基因组物理图谱比较,观察到少量酶切位点的差异。PiraGV-E3基因组中17个EcoRⅠ位点中的14个与PiraGV英国分离株ArGV1基因组中19个EcoRⅠ位点中的14个位点位置相一致,但PiraGV-E3基因组中缺失了ArGV1另外的5个EcoRⅠ位点,同时在基因组其他位置增加了3个EcoRⅠ位点。 3.PiraGV DNA polymerase(dnapol)基因的研究:PiraGV dnapol编码框包含3135个核苷酸,编码一个1045个氨基酸组成的预计分子量为122.16kDa的蛋白质。PiraGV dnapol基因与其他的杆状病毒的dnapol基因有28-70%的氨基酸同源性。与其他的杆状病毒dnapol基因一样,PiraGV dnapol基因包含有保守的3’-5’外切核酸酶的基序(motif)以及DNA结合功能域(domain)。Northern杂交显示,在PiraGV感染的菜粉蝶幼虫体内,dnapol基因的转录产物主要为3.7kb的mRNA。5’和3’cDNA末端快速扩增(RACE)显示PiraGV dnapol基因的转录产物起使于翻译起使密码子ATG上游-378的T,终止于一个poly(A)信号序列AATAAA。基于dnapol基因的系统进化分析显示PiraGV与苹果小卷叶蛾颗粒体病毒(Cydia pomonellaGV,CpGV),云杉卷叶蛾颗粒体病毒(Choristoneura occidentalis GV,ChocGV)和苹果异形小卷蛾颗粒体病毒(Cryptophlebia leucotreta GV,CrleGV)在进化关系上最为密切。 4.PiraGV的全基因组测序:PiraGV基因组全长108476bp,碱基组成中A+T含量为66.8%,预测PiraGV基因组含有125个orf(≥150nt),其中29个orf是在目前所有已经测序的杆状病毒基因组中都具有的,30个orf是颗粒体病毒所特有的,6个orf是PiraGV所特有的。在基因组中的非编码区,鉴定了4个同源重复区域(homologous regions,hrs),这些hrs中缺乏核型多角体病毒基因组中典型的hrs中所存在的回文序列,PiraGV hrs之间具有同源性,与其他GVs的hrs无明显的同源性。在PiraGV orf23和orf24之间的785bp区域,富含AT,并且存在着大量的重复序列、反向重复序列和回文序列,这一区域类似于CrleGV和ChocGV基因组中的DNA复制起始原点所在的非同源重复区域(non-homologous region,non-hr)。就同源蛋白的平均相似性而言,PiraGV与ChocGV的同源性最高(57.4%),其次是CpGV(54.4%)和CrleGV(54.4%)。GeneParityPlot分析显示:PiraGV基因组的基因内容和排列与感染卷叶蛾科的CpGV,ChocGV和CrleGV基因组呈现了高度的共线性关系。


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