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《广西大学》 2008年
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猪体细胞核移植相关技术研究

黄雅琼  
【摘要】: 1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。(1)不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径>2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD(germinal vesicle breakdown);卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期(diakinesis,DK)的比率达到峰值(27.06%),而MⅠ的峰值(69.69%)出现在培养后28h;成熟培养32~44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高(53.33%);成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值(63.64%)。(2)不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径<2mm、直径2~6mm、直径>6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径<2mm和>6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2~6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率(P<0.05)。直径2~6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。 2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显著高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素(hMG)的卵母细胞成熟率(P<0.05),但两组间的分裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子(EGF)的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显著高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子(IGF-I)显著提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显著提高猪卵母细胞的孤雌发育能力(P<0.05)。分别使用以TCM-199、NCSU-23(North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液)和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显著(P>0.05),表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。 3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:(1)浓度为9%的乙醇(EH)激活处理10min效果好于15min;(2)用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养处理3~4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显著高于再用10μg/mL放线菌酮(CHX)+10mmol/L SrCL_2(Sr~(2+))、10 mmol/L Sr~(2+)+2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr~(2+)培养处理3~4h的卵母细胞。(3)比较几种激活方法(5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次)的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素(Ion)的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。(4)卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显著影响,4~6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率(68.99%和75.36%)和囊胚率(32.56%和37.68%)显著高于其它组(p<0.05)。 4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5~6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11d和8~9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3~5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。 5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。(1)猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率(58.99%和56.51%)、卵裂率(67.52%和65.73%)和囊胚率(22.78%和15.96%)较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞(P<0.05)。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞(P<0.05)。(2)盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者(P<0.05);三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低(P<0.05),但融合率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。(3)不同注核方法(细胞质内注射法和透明带下注射法)的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为(68.13%和60.37%)与囊胚率(6.44%和8.08%)差异均不显著(P>0.05)。 6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。(1)比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率(64.74%)高于颗粒细胞(51.05%)和卵丘细胞(56.89%),但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显著(P>0.05)。(2)不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6~9代的融合率显著高于3~5代和>10代的成纤维细胞(P>0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。(3)不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显著(P>0.05),但囊胚率显著低于雌性胎儿成纤维细胞(P<0.05)。(4)100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70~80%汇合的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著。(5)猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),虽然融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。(6)表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显著高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率(P<0.05),虽然融合率差异不显著(P>0.05)。(7)直径<15μm的供体细胞核移植后的融合率显著低于直径>30μm的供体细胞(P<0.05),直径20~3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高。(8)组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q813

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【引证文献】
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8 魏丽;付忠亮;李昌坤;王心朋;;影响镁合金板材冲压成形性能的因素[A];十三省区市机械工程学会第五届科技论坛论文集[C];2009年
9 魏丽;付忠亮;李昌坤;王心朋;;影响镁合金板材冲压成形性能的因素[A];自主创新与持续增长第十一届中国科协年会论文集(2)[C];2009年
10 杨坚;訾跃平;;优化抄纸助留体系 促进企业效益提高[A];'2010(第十八届)全国造纸化学品开发及造纸新技术应用研讨会('2010全国造纸化学品开发与造纸新技术应用高层论坛)论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 兴业证券 王年华 饶刚 刘景;小盘股收益率影响因素实证分析[N];中国证券报;2000年
2 马平东;塑料软包装印刷色差的影响因素[N];中国包装报;2006年
3 石家庄软包装彩印厂 姜志绘;干式复合强度的影响因素[N];中国包装报;2001年
4 伊京;药品不良反应报告制度的影响因素[N];医药经济报;2003年
5 北大人口所 郑晓瑛教授;人口出生质量及影响因素(八)[N];中国人口报;2000年
6 农发所 翁鸣;我国农产品国际贸易及其影响因素[N];中国社会科学院院报;2005年
7 深圳证券信息公司 赵迪;开放式基金申购赎回行为影响因素[N];中国证券报;2004年
8 林诗萍 DigiTimes;笔记本电池问题频仍[N];电子资讯时报;2006年
9 张横;丝网印刷中绷网质量的影响因素解析[N];中国包装报;2008年
10 本报记者 熊伟;条件尚未成熟 决策孕育之中[N];计算机世界;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 黄雅琼;猪体细胞核移植相关技术研究[D];广西大学;2008年
2 宋继梅;东北虎体细胞异种核移植[D];西北农林科技大学;2007年
3 赛务加甫;提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D];西北农林科技大学;2007年
4 张刚;小鼠胚胎细胞和体细胞核移植及原核置换研究[D];山东师范大学;2005年
5 李雪峰;牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植[D];西北农林科技大学;2001年
6 潘登科;影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究[D];中国农业大学;2005年
7 杨素芳;水牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植的研究[D];广西大学;2002年
8 陈颖;MSTN基因敲除猪胚胎成纤维细胞的构建及其基因敲除猪的初步研究[D];吉林大学;2007年
9 赵淑芳;普京执政以来的俄美关系[D];中共中央党校;2005年
10 白照岱;小鼠体细胞核移植和胚胎分割相关问题研究[D];山东大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋晓明;小鼠体细胞核移植方法的研究[D];南京农业大学;2004年
2 张晓建;绵羊卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植[D];西北农林科技大学;2005年
3 李斌;山羊核移植中供体和受体细胞的准备及融合激活参数的研究[D];安徽农业大学;2005年
4 刘伟;猪体细胞核移植的初步研究[D];南京农业大学;2007年
5 梅志强;小鼠卵丘细胞自体与异体核移植的探索[D];中国农业大学;2005年
6 魏著英;杂合孤雌胚胎干细胞的分离及其分化潜能的研究[D];内蒙古大学;2008年
7 张红琴;成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的研究[D];内蒙古农业大学;2007年
8 王申元;成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的生产[D];内蒙古农业大学;2009年
9 李垚;影响小鼠核移植胚发育因素的研究[D];湖南农业大学;2005年
10 孙明辉;猪卵丘细胞核移植的核质关系研究[D];西南大学;2006年
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