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影响低毒病毒累积量的病毒基因定位及其作用机制的研究

林海燕  
【摘要】: 低毒病毒(hypovirus)是一类存在于细胞质中的,无衣壳双链RNA病毒,因可以降低宿主板栗疫病菌的致病力而得名。根据遗传结构的不同,目前发现的低毒病毒可以归为四个种:CHV1、CHV2、CHV3和CHV4。迄今为止有六个低毒病毒分离株的全基因组序列已被报道,其中属于CHV1的有三个病毒株,即CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721。 感染了CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721的板栗疫病菌菌株均表现出典型的低毒病毒相关症状。相对于CHV1-EP713来说,CHV1-Euro7和CHV1-EP721属于较为温和的病毒。序列对比分析显示,CHV1-EP721与CHV1-Euro7和CHV1-EP713在核苷酸水平上的同源性平均为99%和90%;在氨基酸水平上的同源性平均为98%和92%。但是CHV1-EP721在宿主中的累积量明显低于另外两个病毒。 利用CHV1-EP721、CHV1-Euro7和CHV1-EP713的侵染性cDNA克隆,通过转染的方法将三种病毒分别导入EP155、Euro7(-v)和EP721(-v)三个不同遗传背景的无病毒菌株中,获得三组共九株不同组合的转染低毒菌株,它们均显示出低毒菌株的表型特征。检测转染菌株中病毒dsRNA的累积量,结果显示:尽管遗传背景不同,但同一病毒在不同的宿主中的病毒累积量均是相似的,结果说明病毒dsRNA在宿主中的累积量仅有病毒本身决定,与宿主无关。 利用CHV1-EP721、CHV1-Euro7和CHV1-EP713较高的序列同源性,构建了CHV1-EP721和CHV1-Euro7,CHV1-EP721和CHV1-EP713之间ORF A/ ORF B互换的嵌合病毒。对转染株中的病毒dsRNA进行半定量分析显示,带有CHV1-EP721 ORF B的嵌合病毒713A721B和721AE7B的转染株中病毒dsRNA的累积量最低,而带有CHV1-EP713 ORF B的嵌合病毒721A713B累积量最高,表明影响低毒病毒累积量的病毒基因位于ORF B中。利用三个野生病毒和四个嵌合病毒对病毒通过分生孢子的传播效率进行检测,结果表明,低毒病毒通过分生孢子的传播效率与病毒在宿主中的累积量呈正相关。 为了定位ORF B中影响低毒病毒累积量的病毒基因,本研究进一步构建了CHV1-EP721和CHV1-Euro7的系列ORF B嵌合病毒721/E7 NarI,E7/721 NarI,721/E7 PH,E7/721 PH,721/E7(5.3-7.8 k)和E7/721(5.3-7.8k)。并通过转染的方式导入无病毒野生型寄主EP721(-v)中,对转染株的病毒dsRNA累积量进行半定量分析,结果显示E7/721(5.3-7.8K)的累积量完全降低到CHV1-EP721的水平,而721/E7(5.3-7.8K)的累积量是CHV1-Euro7的70%。这些结果表明,决定病毒累积量的病毒基因定位于CHV1-EP721的ORF B中5.3-7.8k的区域,并且在ORF B中还存在着另外的与此基因编码产物相互作用而影响低毒病毒累积量的病毒基因。 为了进一步研究病毒ORF B的5.3-7.8kb片段的编码产物在低毒病毒复制过程中的作用机制,构建了一系列携带5.3-7.8 kb区域不同片段长度的质粒pTr5.4、pTr4.1和pTr2.5,以测定其反式作用的效率。用这三种质粒对EP721进行转化,均筛选到促进病毒累积量的转化株,表明影响低毒病毒累积量的病毒基因产物可以通过反式作用增加病毒的累积水平。用融合了EGFP基因egfp的质粒pTr2.5G进行转化,不影响5.3-7.8 kb区域的反式互补作用。利用GFP方便的选择标记,进一步构建了带有GFP融合标签的CHV1-Euro7 ORF B中5.3-7.8 kb区域的不同片段长度的转化质粒pTr57G(5.3-7.0k)、pTr68G(6.4-7.7k)和pTr67G(6.4-7.0k)并分别用于转化EP721原生质体。三种质粒的转化株中均筛选到病毒累积量明显增加的转化株,从而将影响低毒病毒累积量的病毒基因精确定位到ORF B中6.4-7.0kb之间约600bp的区域。 CHV1-EP721与CHV1-Euro7相比ORF B的6.4-7.0 kb区域中有四个氨基酸不同。对CHV1-EP721 ORF B相应片段的差异氨基酸的DNA序列分别进行突变,使Val(1426)突变为Ala,Lys(1439)突变为Glu,Glu(1495)突变为Gly,His(1496)突变为Arg。对带有点突变的6.4-7.0 kb片段反式转化株的病毒dsRNA累积量检测结果显示上述四个氨基酸中任一位点的突变都显著降低该片段的反式作用能力,病毒累积量无法达到野生型病毒相应片段反式增加的水平。 本研究利用原核表达系统体外表达了低毒病毒ORF B中6.1-6.8 kb的序列,获得表达产物P4,免疫家兔制备了效价高达1∶10000的抗体;并利用Biacore分子相互作用系统初步分析了P4与其他病毒编码蛋白之间的相互作用。 本论文中对影响低毒病毒累积量的病毒基因的定位及其作用机制的研究为探明低毒病毒的复制机制提供了参考依据。


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