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《广西医科大学》 2011年
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肝癌相关抗原GCF2基因同源片段的原核表达及鉴定

肖飞  
【摘要】:目的构建肝癌相关抗原GCF2基因同源片断(323-1234bp)原核表达重组质粒,并进行原核表达和鉴定,为后续研究奠定基础。 方法(1)利用互联网上蛋白质数据库软件对人GCF2蛋白序列进行生物信息学分析;(2)提取人肝癌组织总RNA,通过逆转录酶合成cDNA;根据GenBank公布的GCF2基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出人GCF2基因片断(编号2-5a),将此片段连接在克隆载体pGEM-T Easy上进行测序,通过酶切、连接将目的片断重组到原核表达载体pET-30a上。将重组质粒pET-30a/GCF2-5a转化DH5a菌,通过PCR鉴定筛出正确的重组子,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,采用不同的IPTG加入时机及加入浓度、诱导温度、诱导时间对工程菌进行诱导表达,并通过SDS-PAGE电泳鉴定,以找出最适诱导条件;所得融合蛋白送蛋白质串联质谱分析鉴定。 结果(1)人GCF2蛋白生物信息学分析结果表明: GCF2蛋白由752个氨基酸构成,分子量约83kDa,等电点为4.55,无跨膜螺旋,无信号肽;存在较多的T细胞表位。 (2)酶切电泳鉴定结果显示GCF2基因同源片段克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GenBank中GCF2基因相应序列完全相符;目的基因正确插入表达载体pET-30a质粒的多克隆位点,成功诱导表达出His-GCF2-5a融合蛋白,确定了pET-30a/GCF2-5a体外表达的优化条件:37℃振荡培养3个小时后,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,继续在30℃振荡培养3小时,可获得较优表达效果;蛋白质飞行质谱仪分析所得的肽段与目的蛋白相符。 结论(1)利用生物信息学分析软件预测了GCF2蛋白的结构域及抗原性,显示GCF2具有较强的免疫原性和较多的T表位;(2)获得了含人GCF2基因同源片段重组原核表达质粒pET-30a/GCF2-5a,并成功表达出His-GCF2-5a融合蛋白。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.7

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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