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《广西医科大学》 2011年
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HPV58mE6E7融合基因疫苗构建及其免疫效果的研究

王鹤  
【摘要】:子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。据世界范围内统计,每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例,其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年有新发病例约13.15万,占世界宫颈癌新发病例总数的28.8%。近10余年来以大规模人群为基础的流行病学资料显示:在99%以上的宫颈癌中存在HPV DNA, HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有宫颈癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达,HPV病毒蛋白可作为一种抗原刺激机体产生针对HPV的免疫反应,这就促使人们希望通过疫苗的方法来治疗和预防宫颈癌。由于各型HPV之间没有交叉保护作用而HPV基因型的分布又存在地域差异,并且目前尚无关于广西地区宫颈癌HPV感染分子流行病学的详细报道。为使本地区疫苗研制更具有针对性,我们对广西地区HPV感染情况、基因型分布以及感染率高的HPV基因型病毒负载量进行了调查,拟提供一份比较可信的的资料,为广西HPV疫苗研制提供有力的依据。 我们采用以PCR测序为基础的方法检测了135例宫颈癌确诊病人的宫颈组织DNA。结果显示:133例宫颈癌病人感染了HPV,感染率98.52%。感染HPV16、18、31、33、35、45、52、58、59型的患者分别为125、76、17、0、0、1、2、63、5例,感染率分别为:93.98%、57.14%、12.78%、0、0、0.75%、1.50%、47.37%、3.76%,其中感染率排在前三位的是16、18和58型。通过real-time Q-PCR对HPV16、18和58型进行定量检测,三者的病毒负载量均值分别为7.89×109、9.55×103和2.38×10。HPV16型的病毒负载量明显高于18和58型(P值0.05),而HPV18型的病毒负载量与58型比较无显著差异(P值0.05)。 由于HPV58型在广西的感染率非常高,因此,研制HPV58型疫苗非常必要。HPV58 E6和E7基因作为癌转化蛋白,能在HPV58(+)肿瘤中将病毒DNA整合到细胞染色体中并持续表达E6、E7蛋白,使宿主细胞向恶性方向转化。尽管如此,E6和E7蛋白作为持续存在病毒抗原,却能刺激机体产生较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL。因此,E6、E7作为一种较理想的肿瘤相关抗原,适用于免疫治疗和预防与HPV58感染导致的宫颈癌的免疫治疗,但前提是必须消除E6、E7基因的转化活性以保证疫苗的安全性。因此,我们在构建疫苗之前,对E6和E7基因的6个转化活性位点进行了点突变,以消除转化活性而保留免疫原性。在证实已消除了HPV58mE6E7(突变后)融合基因转化活性的基础上,将其与人IgG Fc段融合在一起形成HPV58mE6E7-Fc,在其前端加上信号肽,后端加上膜锚定蛋白GPI,使上述肿瘤抗原能够锚定在细胞膜上表达。最后将sig-HPV58mE6E7Fc-GPI片段插入我室前期构建的能够融合表达GM-CSF和B7.1蛋白的真核表达载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游,构建了PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗。使该疫苗在表达上游融合抗原的同时,又能表达下游的GM-CSF和B7.1分子,以此来增进疫苗的协同免疫作用。随后,我们又构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的小鼠黑色素瘤B16-HPV58E6E7细胞系,原核表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白抗原,为后续动物实验奠定基础。 动物实验中,我们采用肌肉注射加在体局部电脉冲的方法,将前期构建的P VAX 1-HP V58mE6E7FcGB融合基因疫苗免疫C57BL/6小鼠。结果表明,经疫苗免疫后的小鼠,对HPV58E6E7(+)肿瘤的攻击具有免疫保护作用。在抗肿瘤移植保护实验中,疫苗组小鼠皮下接种的成瘤潜伏期时间长于对照组(P0.05)。在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢,最终使小鼠生存期延长,平均瘤重低于对照组(P0.05)。研究结果还证实经疫苗免疫的小鼠,可诱发血清特异性抗体,抗体滴度最高可达1:25600,与对照组比较,差异有显著性(P0.05)。ELISPOT可以检测到重组抗原HPV58E6E7-GST蛋白诱导的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞,疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数明显多于单独抗原组(PO.05),说明HPV58mE6E7融合基因辅以人IgG Fc段、GM-CSF和B7.1等佐剂后,可明显增强HPV58mE6E7融合基因的免疫原性,加强其细胞免疫。通过LDH法,我们还检测到PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗杀伤B16-HPV58E6E7细胞的CTL反应最高达45%。说明经该疫苗免疫后的小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫。在一定程度上保护免疫小鼠免受B16-HPV58E6E7细胞(1~2×10。)的攻击。 为提高疫苗的免疫效果,我们随后将分子佐剂更换为hIL12,构建了PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL 12疫苗并实现了真核表达,准备进行动物实验。 总之,我们在对广西HPV感染分子流行病学调查的基础上构建并表达了的PVAX1-HPV58mE6E7FcGB融合基因疫苗,对免疫后小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫,可以作为HPV58(+)宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗的候选疫苗,对于清除HPV58型感染相关的肿瘤细胞、阻止病变的发展将有一定的临床价值。
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