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《广西医科大学》 2011年
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红霉素对香烟刺激的人巨噬细胞组蛋白去乙酰化酶和核因子-κB的影响及机制研究

李梅华  
【摘要】:第一部分:红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞释放炎症介质的影响的实验研究 目的(一)探讨香烟烟雾诱导人巨噬细胞产生炎症反应的分子学机制。(二)从抗炎的角度来探讨红霉素(EM)对香烟烟雾诱导的人巨噬细胞释放炎症介质的影响。 方法体外培养人类单核细胞系U937细胞,用佛波脂(PMA,10ng/ml)将其诱导分化为人巨噬细胞。按传统方法制备好香烟烟雾提取物(CSE)用于实验。将传代后的细胞分组:①对照组,②CSE组(加入1%CSE孵育24h),③红霉素+CSE组(1μg/ml红霉素预孵育24h后,加入1%CSE继续孵育24h)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液的细胞因子白介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-а)的浓度。数据用均数±标准差(?x±s)表示,两组间比较采用成组计量资料t检验,多组间比较采用方差分析(ANOVA分析),P 0.05表示差异有统计学意义。 结果(一) 1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,与对照组比较,巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: CSE组281.53±89.98,对照组217.82±83.01;n=7,P 0.05;)和TNF-а的含量(pg/mL: CSE组729.25±44.17,对照组316.60±224.89;n=6,P 0.05;)均明显增高。 (二)红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激人巨噬细胞24小时,与CSE组比较,巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: CSE+EM组203.14±95.77,CSE组281.53±89.98;n=7,P 0.05)和TNF-а的含量(pg/mL: CSE+EM组510.29±309.83,CSE组281.53±89.98;n=6,P0.05)均明显下降。 结论香烟烟雾通过刺激人巨噬细胞释放IL-8和TNF-а等炎症介质引起炎症,这提示是香烟烟雾引起炎症的机制之一。红霉素对香烟烟雾所导致的炎症起重要的调控作用(抑制作用),其作用部分是通过对炎性细胞因子IL-8和TNF-α的抑制而实现的,这是红霉素抗炎作用机制之一。 第二部分:红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞核因子-κB活性的影响的实验研究 目的(一)探讨香烟烟雾对人巨噬细胞核转录因子核因子-κB(NF-κB)活性的影响及其与炎症介质的关系。(二)从抗炎的角度来探讨红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞NF-κB活性的影响。 方法体外培养人类单核细胞系U937细胞,用PMA将其诱导分化为人巨噬细胞。按传统方法制备好CSE用于实验。将传代后的细胞分组:①对照组,②CSE组(加入1%CSE孵育24h),③红霉素+CSE组(1μg/ml红霉素预孵育24h后,加入1%CSE继续孵育24h),④吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组(加入20nM PDTC预孵育24h后,加入1%CSE继续孵育24h)。细胞提取核蛋白,采用电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测NF-κB的活性。采用ELISA法检测细胞上清液IL-8的浓度。数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用成组计量资料t检验,多组间比较采用方差分析(ANOVA分析),P 0.05表示差异有统计学意义。 结果(一)1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,巨噬细胞核转录因子NF-κB活性显著增强。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激巨噬细胞24小时,NF-κB活性被抑制;当红霉素预孵育时间延长至48小时,NF-κB活性被抑制更明显。作为阴性对照组,NF-κB的特异性抑制剂PDTC组的NF-κB活性明显被抑制。 (二)1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,细胞释放IL-8含量增高(ng/L: CSE组264.93±14.89,对照组103.52±3.33;n=6,P 0.05)。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激人巨噬细胞24小时,细胞释放IL-8含量下降(ng/L: CSE+EM组196.70±14.13,CSE组264.93±14.89;n=6,P 0.05)。NF-κB特异性抑制剂PDTC抑制香烟烟雾刺激的人巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: PDTC组95.06±5.86,CSE组264.93±14.89;n=6,P 0.05)。 结论实验结果提示香烟烟雾诱导人巨噬细胞发生炎症的分子学机制之一是通过激活巨噬细胞的核转录因子NF-κB继而促使炎症介质IL-8的释放实现的。红霉素抑制香烟烟雾诱导的炎症的途径之一是通过抑制NF-κB活性从而抑制炎症细胞因子IL-8的表达,这是红霉素抗炎作用的部分分子学机制之一。 第三部分:红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞核组蛋白去乙酰化酶表达的影响的实验研究 目的(一)探讨香烟烟雾对人巨噬细胞组蛋白去乙酰化酶(HDAC)表达的影响及其与NF-κB,炎症介质的关系。(二)从抗炎的角度来探讨红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞HDAC总活性和HDAC1,2,3蛋白表达的影响其与NF-κB,炎症介质的关系。 方法体外培养人类单核细胞系U937细胞,用PMA将其诱导分化为人巨噬细胞。按传统方法制备好CSE用于实验。将传代后的细胞分组:对照组、CSE组(加入1%CSE孵育24h)、红霉素+CSE组(1μg/ml红霉素预孵育24h后,加入1%CSE继续孵育24h)、HDAC的特异性抑制剂曲古霉素(TSA)组(加入TSA100ng/ml孵育24h),细胞提取核蛋白,采用比色法检测细胞HDAC活性和Western blot法检测细胞HDAC1,HDAC2,和HDAC3和NF-κB蛋白表达。采用ELISA法检测细胞培养上清液的细胞因子IL-8和TNF-а的浓度。数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用成组计量资料t检验,多组间比较采用方差分析(ANOVA分析),P 0.05表示差异有统计学意义。 结果(一)1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: CSE组281.53±89.98,对照组217.82±83.01;n=7,P 0.05)和TNF-а的含量(pg/mL: CSE组729.25±444.17,对照组316.60±224.89;n=7,P 0.05;)均明显增高。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激人巨噬细胞24小时,巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: CSE+EM组203.14±95.77,CSE组281.53±89.98;n=7,P 0.05)和TNF-а的含量(pg/mL: CSE+EM组510.29±309.83,CSE组281.53±89.98;n=7,P 0.05)均明显下降。此外,HDAC的特异性抑制剂TSA组的人巨噬细胞释放IL-8的含量(ng/L: TSA组232.21±109.67,对照组217.82±83.01;n=7,P 0.05)和TNF-а的含量(pg/mL: TSA组428.71±371.00,对照组316.60±224.89;n=7,P 0.05)均明显升高。 (二)1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,与阳性对照组比较,巨噬细胞HDAC总活性明显减弱(微摩尔对硝基苯/分钟: CSE组0.0803±0.0431,阳性对照组0.2455±0.0595;n=4,P 0.05)。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激巨噬细胞24小时,与CSE组比较,巨噬细胞HDAC总活性增强(微摩尔对硝基苯/分钟: CSE+EM组0.0865±0.05081,CSE组0.0803±0.0431;n=4,P 0.05)。作为阴性对照组,HDAC的特异性抑制剂TSA组的HDAC总活性被抑制。 (三)1%CSE刺激人巨噬细胞24小时后,与对照组比较,巨噬细胞HDAC1,2,3表达水平均下降,以HDAC2改变明显。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激巨噬细胞24小时,与CSE组比较,巨噬细胞HDAC1,2,3表达均增强,以HDAC2改变明显。作为阴性对照组,HDAC的特异性抑制剂TSA组的HDAC1,2,3表达明显被抑制。 (四) 1%CSE刺激巨噬细胞24小时后,细胞NF-КB蛋白表达增强。红霉素(1ug/ml)预孵育24小时后再予1%CSE刺激巨噬细胞24小时,细胞NF-КB蛋白表达水平下降。HDAC的特异性抑制剂TSA组细胞的NF-КB蛋白表达增强。 结论实验结果提示香烟烟雾诱导人巨噬细胞发生炎症的分子学机制之一是通过抑制巨噬细胞HDAC活性和HDAC1,HDAC2和HDAC3蛋白表达水平(尤其是HDAC2水平)继而激活NF-кB,使NF-кB蛋白表达增加,促使炎症介质的释放实现的。红霉素通过提高HDAC活性及HDAC1,2,3,特别是HDAC2蛋白表达,继而抑制NF-κB的活性和蛋白表达从而抑制炎症基因表达,下调炎症反应,这一机制是红霉素具有免疫调节和抗炎作用的分子学机制之一。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R965

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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