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《广西医科大学》 2011年
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人ⅡA型磷脂酶A_2的进化和衍生多肽抗菌作用的研究

何睿林  
【摘要】:目的:分析亲缘关系密切,但又分属不同种类的灵长类生物ⅡA型磷脂酶A2基因的相关情况,了解ⅡA型磷脂酶A2分子进化的一些特点。 方法:收集已知的灵长类生物人(Homo sapiens)、猩猩(Pan troglodytes)和猴(Macaca mulatta)的ⅠB型和ⅡA型磷脂酶A2 (phospholipase k2,PLA2)的基因和mRNA顺序资料,对两型PLA2进行碱基替代的相关分析,包括转换和颠换、颠换/转换比;碱基替代发生在编码区和非编码区的情况;以及替代发生在密码子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ位上的情况等。 结果:灵长生物PLA2编码区基因发生碱基替代时,ⅠB型和ⅡA型PLA2碱基总替代数在发生人和猩猩之间最少,而人和猴、猴和猩猩之间则碱基替代明显增多,约为前者的5倍和3倍多;ⅠB型PLA2碱基替代在人和猩猩之间以密码子Ⅰ、Ⅲ位最多,各占40%,第Ⅱ位者最少占20%;而在人和猴、猴和猩猩之间按替代频率高低依次为ⅢⅡⅠ位,发生于第Ⅰ、Ⅱ位的总碱基替代百分率为48%-50%,低于发生于第Ⅲ位的50%-52%;人和猴、猴和猩猩之间碱基转换和颠换的比值1,而人和猩猩之间比值1。与ⅠB型PLA2相比,ⅡA型PLA2在三种灵长生物之间的碱基总替代数更多(62 vs 54),碱基替代在密码子中所占的比例也更高;人、猴和猩猩三者之间的碱基替代均以密码子第Ⅲ位最多,占40.7%-50%,发生于Ⅰ、Ⅱ位者在25.9%-33.3%之间,但Ⅰ、Ⅱ位两个位点总的碱基替代率达55.5%-59.2%,明显高于发生于第Ⅲ位者;突变的性质方面,人和猩猩、猴和猩猩之间碱基转换多于颠换,而人和猴之间则相反,颠换略多于转换。在非编码区5’端在人和猩猩间ⅠB型PLA2没有碱基替代,而工ⅡA型PLA2则有2处转换,且人和猴、猴和猩猩之间总替代数达60多次,其中颠换明显多于转换,人和猴、猩猩三者之间的碱基总替代以及转换和颠换占5'端碱基数的百分比明显高于ⅠB型。在非编码区3’端,ⅠB型PLA2在三种灵长生物之间均有1次颠换,人和猩猩之间无碱基转换,而人和猴、猴和猩猩之间各有4次和5次转换,且碱基转换无论数目还是比例都多于颠换。ⅡA型PLA2在三种灵长生物之间的碱基总替代数高于ⅠB型,并且人和猩猩、人和猴之间总替代数及颠换数占3’端碱基数的百分比也明显高于ⅠB型。 结论:1.ⅡA型PLA2分子具有较快的进化速度,存在加速进化现象;2.ⅡA型PLA:加速进化可能与协同进化有关。 目的:研究中国人不同个体间ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2) cDNA和氨基酸顺序的情况,并与已知外国人种的ⅡA型PLA2进行比较,了解人ⅡA型PLA2分子的进化特点。 方法:12名因急性或慢性阑尾炎急性发作施行阑尾切除手术的患者,取其手术切除的阑尾炎症组织50-100mg,以Trizol试剂法匀浆提取总RNA,利用RT-PCR方法分别扩增其ⅡA型PLA2 cDNA,经电泳确认条带清晰的PCR产物送专业测序公司行DNA双向测序,分析测序所获得的DNA及由其推导的氨基酸顺序,并与已知外国人种ⅡA型PLA2的进行比较,观察碱基和氨基酸取代情况,结合测序图谱,分析其分子进化的特点。 结果:从12名不同中国人个体的阑尾炎症组织顺利扩增得到ⅡA型PLA2cDNA,并推导出相应的氨基酸顺序,与已知外国人种的相比较,发现:①扩增得到的ⅡA型PLA2 cDNA顺序与已知外国人种的基本一致;但存在单核苷酸多态性(Single Nucleotide polymorphism, SNPs)。对测序图谱的分析发现,在12例样本中有2例可见突变的单等位基因SNPs位点,分别位于密码子32位和44位,且都发生在突变热点CpG二核苷酸位点上,并存在杂合(CG&CT)和纯合现象。②由ⅡA型PLA2 cDNA推导的氨基酸顺序与已知外国人种的完全一致。 结论:①中国人不同个体间ⅡA型磷脂酶A2的cDNA顺序高度保留,与已知其他人种也一样。多态性位点发生在密码子32和44位上,且都发生在突变热点CpG二核苷酸位点上;②中国人种ⅡA型磷脂酶A2分子一级结构与其他人种完全一致,说明这一在宿主天然免疫系统中发挥重要作用的分子在不同人种间高度保留。 目的:了解人ⅡA型磷脂酶A2 cDNA片段和婴儿利什曼原虫DNA相似性的情况和原因。 方法:搜索NCBI网站基因库并获取人ⅡA型磷脂酶cDNA资料,然后利用BLAST软件,以人ⅡA型磷脂酶cDNA顺序中的片段以每相邻20个碱基(bp)为一组(如1-20;10-30;20-40…,以此类推直至结尾),作为查询序列与核酸数据库进行逐一比对,将获得的一致性片段进行收集、整理并分析、汇总利什曼原虫DNA的相关信息。 结果:发现当DNA片段长度≥17bp,人ⅡA型磷脂酶A2 cDNA与婴儿利什曼原虫DNA之间仅有4个片段一致;而在片段长度≥16bp时,则两者之间有9个片段完全相同,并且这些序列集中分布于婴儿利什曼原虫36条染色体的29、30号染色体上。 结论:人ⅡA型磷脂酶cDNA片段与婴儿利什曼原虫DNA片段之间具有一致性,可能与基因由原虫向人的横向传递有关。 目的:了解灵长生物的抗菌蛋白ⅡA型磷脂酶A2氨基酸取代的特点及其与分子进化的关系。 方法:对人、猩猩和猴3种哺乳类灵长生物的ⅡA型磷脂酶A2的氨基酸顺序进行两两比较,并与ⅠB型磷脂酶A2的相对照,分析它们之间相互取代的位点、频率和性质(极性、非极性;酸性、中性、碱性),利用软件Cn3D4.1构建其蛋白分子的三维晶体结构,了解灵长类(人、猩猩、猴)ⅡA型磷脂酶A2晶体结构中发生氨基酸取代(碱基非同义取代)的位置和区域,总结出它们的变化规律,并与杀菌功能相联系。 结果:(1)人和猩猩、人和猴、猩猩和猴之间ⅡA型磷脂酶A2蛋白分子分别有4、12、12个氨基酸残基发生取代,且主要发生在带电荷的氨基酸;而在发生的氨基酸取代中,又以带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)为主;(2)氨基酸取代主要集中在有限的4个区域,且为功能重要的区域。 结论:哺乳类灵长生物ⅡA型磷脂酶A2的蛋白质分子进化较快,这可能是它能够具有杀菌活性的原因。 目的:观察衍生自人ⅡA型磷脂酶A2 (phospholipase A2 ,ⅡA型PLA2)碳末端(C-terminal)26个氨基酸残基的多肽对不同细菌在体外的杀菌效应,并探讨其杀菌作用机制。 方法:根据人ⅡA型PLA2C末端26个氨基酸残基的顺序,合成为肽P26。采用琼脂铺板计数法,将不同浓度的多肽分别与6种细菌(金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌)在37℃孵育2h,然后铺板并置于37℃恒温箱培养18-24h,记录每一琼脂板上的菌落生成数(CFU),计算出多肽作用后对细菌的杀灭百分率。 结果:肽P26对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌等革兰阳性(G+)菌的杀菌作用较强;对大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌等革兰阴性(G-)菌的杀菌作用较弱。 结论:衍生自人ⅡA型PLA2C末端26个氨基酸残基的多肽有杀菌作用,推测其具有和ⅡA型PLA2及其他抗菌多肽相似的杀菌机制。 目的:研究人ⅡA型磷脂酶A2 (phospholipase A2,ⅡA型PLA2)C末端衍生多肽P26经修饰和改造后对不同细菌的杀菌效应,分析其作用差异及机制。 方法:以人ⅡA型PLA2氨基酸顺序C末端26个氨基酸残基为模板,合成线性多肽P26,然后对此线性多肽分别进行修饰和改造,一是将其环化得到环状多肽,二是将其中的4个碱性氨基酸残基分别替换为非极性疏水性氨基酸和极性中性氨基酸得到一条新的重组多肽。采用琼脂铺板计数法,将不同浓度的三种多肽分别与6种细菌(G+菌的枯草杆菌、炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌;G-菌的大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌)在37℃孵育2h,然后铺板并置于37℃恒温箱培养18-24h,记录每一琼脂板上的菌落数(CFU),并计算多肽作用后的杀菌率。 结果:直链肽和环肽P26对G+菌(包括金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌)有较强的杀菌活性,但环肽的作用更强;对G-菌(包括大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌)的杀菌作用较弱,而环肽的作用更弱;改造后的重组肽P26对G+菌的杀菌活性明显下降,对G-菌则几乎不起作用。 结论:衍生自人ⅡA型PLA2C末端的直链肽和环肽P26对G+菌有较强的杀菌活性,环肽作用更强,推测与其环状结构形成有关;但将其中的4个碱性氨基酸残基替换改造为非碱性氨基酸后的重组肽P26对G+菌的杀菌活性明显下降。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R96

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