~（60）COγ射线照射对豚鼠耳蜗损伤及乙酰半胱氨酸辐射防护的实验研究

【摘要】：目的:放射治疗是鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤的主要治疗手段。在鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤患者的放射治疗时,单侧或双侧耳蜗受到相当于肿瘤治疗剂量的照射,引起放疗后的感音神经性耳聋(sensorineurial hearing loss ,SNHL)的发生,在中国,鼻咽癌放疗后SNHL的发生率可达36%,严重影响患者的生活质量。放射治疗所致的SNHL的发生发展规律仍不清楚,目前对放疗后SNHL尚无有效的治疗方法,给临床治疗工作带来了很大的困扰。因此研究电离辐射引起耳蜗损害的细胞分子机理,对于如何使用抗辐射损伤的药物治疗具有重要的临床意义。本研究旨在通过建立~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗损伤的模型,通过电生理、病理形态学、免疫组织化学染色、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction ,RT-PCR)、脱氧核苷酸末端转移酶介导的dTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling ,TUNEL)等检测技术,观察豚鼠~(60)Coγ射线照射后耳蜗损伤的改变,初步探讨耳蜗损伤发生的可能分子机制,并局部经圆窗膜给予抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)以及观察其对~(60)Coγ射线照射后耳蜗损伤是否具有防护作用,为放射治疗引起的SNHL的治疗寻求安全有效的药物提供实验依据。 方法:本研究分三部分:第一部分,~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗损伤模型的建立;第二部分,~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗细胞凋亡的相关研究;第三部分,乙酰半胱氨酸在~(60)Coγ射线照射引起的耳蜗损伤中的防护作用。 第一部分实验方法:48只白化豚鼠随机分为对照组和放疗组,对照组8只为未进行~(60)Coγ射线照射的健康豚鼠,放疗组40只,以右耳为照射耳,一次性给予耳颞部70Gy~(60)Coγ射线照射,于照射后第1天、第4天、第7天、第14天、第30天行听性脑干反应(auditory brainstem response ,ABR)测听后处死动物,取右侧听泡固定,做耳蜗中轴切片HE染色,每组随机取2只耳蜗做基底膜扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)检查,观察耳蜗组织的形态学病理变化。第二部分实验方法:白化豚鼠130只,分为对照组和放疗组,对照组26只,为未进行~(60)Coγ射线照射的健康豚鼠,放疗组104只,以右耳为照射耳,一次性给予耳颞部70Gy ~(60)Coγ射线照射,并于照射后第1天、4天、7天、14天处死豚鼠行以下相关指标的检测:①耳蜗超氧化物酶( superoxide dismulasc , SOD )和丙二醛(malondialdehyde ,MDA)的检测。②TUNEL法检测耳蜗组织的细胞凋亡情况。③免疫组织化学法检测凋亡蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate specific proteases ,Caspase)3、Caspase8、Caspase9的表达。④蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测耳蜗Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达。⑤RT-PCR检测凋亡基因Bax、Bcl-2和Fas信使核糖核酸(messenger RNA ,mRNA)的表达。第三部分实验方法:白化豚鼠144只,随机分为4组,每组36只,四组分别为:正常组(未进行任何干预的健康豚鼠)、单纯放疗组、生理盐水组(放疗+生理盐水组)、乙酰半胱氨酸药物组(放疗+乙酰半胱氨酸组)。每组均取右耳为实验耳。除正常组外,其余3组均分别在照射后第4天、第14天行以下相关检查:①ABR检测。②耳蜗SOD和MDA的检测。③TUNEL法检测耳蜗组织的细胞凋亡。④免疫组织化学法检测凋亡蛋白Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达。 结果:第一部分,①大体标本观察:70Gy剂量照射后第1天、第4天、第7天所有豚鼠听泡内无积液及脓性分泌物,第14天少数豚鼠有中耳积液,照射后第30天的豚鼠右耳听泡内均有积液或脓性分泌物。②ABR反应阈值:照射后第1天ABR阈值(20.00±4.47 dB nHL)比对照组(11.66±2.58 dB nHL)高,但比较差异无统计学意义(p0.05),照射后第4天ABR阈值(25.00±10.48 dB nHL)与对照组比较差异有统计学意义(p0.05),照射后第7天(46.66±9.31 dB nHL)、第14天(55.00±5.47 dB nHL)ABR阈值与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01),照射后第30天由于豚鼠听泡内有脓性分泌物,ABR阈值最高声强105dB nHL引不出。③HE染色显示:对照组耳蜗组织结构正常,未出现变性萎缩等异常改变,而放疗组的豚鼠耳蜗组织结构在照射后不同时间点均出现了不同程度的损害,并随着照射后观察时间的延长,组织结构损害更加严重。耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)的损伤表现为:细胞萎缩(细胞浆的减少、细胞核浓缩凝集、缺失或者整个细胞的缺失);照射后第1天出现细胞浆轻微萎缩,细胞核未见萎缩,第4天时部分细胞浆出现明显萎缩,少数细胞核也呈现萎缩现象,第7天、14天萎缩的细胞数量明显增多,第30天时可见细胞萎缩程度加剧,甚至出现整个细胞的缺失,空泡形成。耳蜗螺旋器(Corti器)的表现:对照组Corti器,3排外毛细胞及1排内毛细胞排列整齐。观察放疗组Corti器照射后第1天、第4天、第7天的结构可见:整个Corti形态未见明显塌陷,3排外毛细胞及内毛细胞排列尚整齐。照射后第14天、30天出现明显的Corti器塌陷萎缩,有明显外毛细胞缺失的现象。耳蜗血管纹(SV)的表现:对照组血管纹结构正常,未见充血水肿空泡形成,放疗组第1天、第4天血管纹未见明显病理改变,第7天、第14天可见轻微的水肿,第30天才出现明显的的水肿或较多空泡形成。④基底膜扫描电镜结果:扫描电镜观察可见,对照组耳蜗各回的内毛细胞(inner hair cell,OHC)、外毛细胞静(outer hair cell,OHC)纤毛排列整齐、形态正常,OHC的静纤毛呈V型,IHC静纤毛略呈弓形。放疗组可见不同程度的纤毛排列紊乱、倒伏、融合、残缺甚至缺失,这种变化在第三排OHC比较明显,并随着照射后时间的延长,以上变化更加突出。照射后第1天毛细胞纤毛无明显倒伏缺失,部分第三排OHC纤毛排列紊乱、转向,但是第4天第三排OHC纤毛排列转向紊乱并出现缺失现象,第7天时OHC纤毛出现紊乱融合和缺失,以第三排OHC明显,IHC纤毛也出现紊乱或缺失。第14天时三排毛细胞纤毛均出现明显融合和缺失现象。第30天时三排OHC出现大量的缺失,IHC纤毛排列紊乱,部分缺失。第二部分:①SOD活力和MDA水平的测定:对照组耳蜗SOD活力(41.61±26.49 U/mgprot)较高,照射后第1天(14.08±2.90 U/mgprot)、第4天(11.83±2.74 U/mgprot)、第7天(11.30±2.98 U/mgprot)、第14天(8.70±1.29 U/mgprot)各不同时间点SOD活力与对照组比较,差异有显著性统计学意义(p0.01),随着照射后时间的延长,SOD活力呈逐渐递减趋势。对照组耳蜗MDA含量(0.24±0.09 nmol/mgprot)较低,其与照射后第1天(0.49±0.10 nmol/mgprot)组比较,差异无统计学意义(p0.05),照射后第4天(0.66±0.26 nmol/mgprot)、7天(0.88±0.30 nmol/mgprot)、14天(0.84±0.13 nmol/mgprot)组与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。②Tunel检测结果:光学显微镜下可见Tunel法使凋亡细胞的细胞核呈亮棕黄色为阳性表达,非凋亡细胞核呈淡蓝色。对照组SGC、Corti器、SV均未见凋亡细胞,放疗组Corti器、血管纹未见明显凋亡细胞。SGC对照组未见凋亡细胞数,而放疗组可见明显染成棕黄色的凋亡细胞,对螺旋神经节细胞凋亡比率进行了统计,发现照射后第1天(5.20±1.40 %)与对照组(0.00±00 %)比较差异无统计学意义(p0.05),放疗后第4天(16.00±1.10 %)、第7天(19.00±4.20 %)、第14天(32.00±8.70 %)与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。③免疫组织化学染色结果显示:Caspase3、Caspase8、Caspase9在螺旋神经节细胞中的阳性表达为细胞浆的棕黄色颗粒,Caspase3、Caspase8、Caspase9在耳蜗组织中的阳性表达在SGC中明显,在Corti及血管纹中表达不明显。SGC的Caspase 8在照射后第1天(0.12±0.01)、第4天(0.23±0.04)、第7天(0.11±0.01)、14天(0.21±0.03)的平均光密度值与对照组(0.05±0.02)的平均光密度值比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。照射后第1天SGC的Caspase 3平均光密度值(0.10±0.02)与对照组(0.07±0.01)比较差异有统计学意义(p0.05),照射后第4天(0.11±0.02)、第7天(0.14±0.01)、第14天(0.10±0.01) SGC的Caspase 3平均光密度值与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01),照射后第1天SGC的Caspase 9平均光密度值(0.11±0.01)与对照组(0.12±0.01)比较差异无统计学意义(p0.05),照射后第4天(0.22±0.03)、第7天(0.35±0.02)、第14天(0.29±0.02 )SGC的Caspase 9平均光密度值与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。④WB检测结果:对照组豚鼠耳蜗中可见少量Caspase3、8、9蛋白的表达,放疗组可见Caspase3的表达上调,其中照射后1天的灰度值(0.59±0.09)与对照组(0.23±0.07)比较差异有统计学意义(p0.05),照射后第4天(0.58±0.19)、14天(0.54±0.05)与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。放疗组可见Caspase9的表达上调,其中照射后1天的灰度值(2.06±0.24)与对照组(0.46±0.09)比较差异有统计学意义(p0.05),照射后第4天(2.05±0.13)、14天(1.94±0.25)与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。照射后第1天(0.68±0.09)、第4天(0.75±0.19)、第7天(0.95±0.25)的Caspase8灰度值与对照组(0.46±0.09)比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。⑤RT-PCR结果:对照组豚鼠耳蜗中可见少量Fas、Bax、Bcl-2 mRNA的表达,放疗组可见Fas mRNA表达上调,其中照射后第1天(2.13±1.23)与对照组(0.80±0.37)的灰度值比较差异有统计学意义(p0.05),照射后第4天(2.92±2.06)与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。照射后第1天(1.90±1.20)、第4天(1.81±1.54)Bax mRNA灰度值与对照组比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。照射后各不同时间Bcl-2 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(p0.05)。第三部分:①ABR阈值测定:NAC药物组(第4天组)(26.25±8.53 dBnHL)与单纯放疗组(第4天)(25.00±10.48 dBnHL)的ABR阈值比较差异无统计学意义(p0.05),NAC药物组(第14天组)(41.25±11.08 dBnHL)与单纯放疗组(第14天)(55.00±5.47 dBnHL)的ABR阈值比较差异有显著性统计学意义(p0.01),正常组ABR阈值(11.66±2.58 dBnHL)较低,其与单纯放疗组(第4天、14天)ABR阈值比较,差异有显著性统计学意义(p0.01)。②扫描电镜发现:正常组内外毛细胞排列整齐,外毛细胞纤毛呈V型,内毛细胞纤毛略呈弓形。4天组中单纯放疗组、生理盐水组第三排外毛细胞纤毛排列紊乱,并出现缺失,而NAC药物组毛细胞纤毛无明显缺失及倒伏。14天组中单纯放疗组和生理盐水组外毛细胞纤毛倒伏变形或缺失,内毛细胞纤毛无明显缺失,部分倒伏,而NAC药物组外毛细胞纤毛无明显缺失,排列稍紊乱,内毛细胞纤毛有部分倒伏。③SOD活力和MDA含量的测定: NAC药物组(第4天)(17.27±3.80 U/mgprot)的SOD活力与单纯放疗组(第4天)(11.84±2.74 U/mgprot)的SOD活力比较差异有统计学意义(p0.01),NAC药物组(第14天)(10.65±2.95 U/mgprot)的SOD活力与单纯放疗组(第14天)(8.70±1.29 U/mgprot)的SOD活力比较差异有统计学意义(p0.05),正常组耳蜗SOD活力(41.61±26.49 U/mgprot)较高,其与单纯放疗组(第4天、14天)的SOD活力比较,差异有显著性统计学意义(p0.01)。NAC药物组(第4天)(0.40±0.20 nmol/mgprot)的MDA水平与单纯放疗组(第4天()0.66±0.26 nmol/mgprot)比较差异有统计学意义(p0.05),NAC药物组(第14天)(0.33±0.05nmol/mgprot)与单纯放疗组(第14天)(0.84±0.13 nmol/mgprot)比较差异有统计学意义(p0.01),正常组耳蜗MDA含量(0.24±0.09 nmol/mgprot)较低,其MDA含量与单纯放疗组(第4天、14天)比较,差异有显著性统计学意义(p0.01)。④免疫组织化学染色:NAC药物组(第4天)(0.12±0.02)与单纯放疗组(第4天)(0.23±0.04)的Caspase8平均光密度值比较差异有显著性统计学意义(p0.01),NAC药物组(第4天)(0.09±0.01)与单纯放疗组(第4天)(0.11±0.02)的Caspase3平均光密度值比较差异有统计学意义(p0.05),NAC药物组(第4天)(0.18±0.01)与单纯放疗组(第4天)(0.22±0.03)的Caspase9平均光密度值比较差异有统计学意义(p0.05)。NAC药物组(第14天)(0.09±0.03)与单纯放疗组(第14天)(0.21±0.03)的Caspase8平均光密度值比较差异有显著性统计学意义(p0.01),NAC药物组(第14天)(0.08±0.02)与单纯放疗组(第14天)(0.10±0.01)的Caspase3平均光密度值比较差异有显著性统计学意义(p0.01),NAC药物组(第14天)(0.21±0.02)与单纯放疗组(第14天)(0.29±0.02)的Caspase9平均光密度值比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。生理盐水组(第4天,第14天)与单纯放疗组的Caspase 3、Caspase8、Caspase9平均光密度值比较,差异无统计学意义(第4天,第14天)(p0.05)。⑤TUNEL染色:正常组的耳蜗螺旋神经节细胞未见明显棕黄色的凋亡细胞,而单纯放疗组和生理盐水组可见较多凋亡细胞,NAC药物组的凋亡细胞数比单纯放疗组和生理盐水组少, NAC药物组(第4天)(6.40±1.80 %)的螺旋神经节细胞凋亡比率与单纯放疗组(第4天)(16.00±1.10 %)的凋亡比率比较差异有显著性统计学意义(p0.01)。NAC药物组(第14天)(7.80±1.79 %)的螺旋神经节细胞凋亡比率与单纯放疗组(第14天)(32.00±8.70 %)的凋亡比率比较差异有统计学意义(p0.05)。单纯放疗组(第4天、14天)与生理盐水组(第4天、14天)比较差异无统计学意义。 结论: 1. 70Gy的~(60)COγ射线照射豚鼠耳颞部后,能引起听力及耳蜗组织结构的损伤,随着照射后时间的延长,其损害更明显,成功建立了~(60)CO照射后耳蜗损伤模型。 2. ~(60)COγ射线照射可致豚鼠耳蜗SOD活力下降,MDA水平升高。 3. ~(60)COγ射线照射后可引起凋亡基因Fas及Bax mRNA表达上调,凋亡蛋白Caspase3、8、9表达也上调。 4.细胞外凋亡途径和线粒体途径均参与了~(60)COγ射线照射所致的耳蜗细胞凋亡。 6.乙酰半胱氨酸可提高豚鼠耳蜗抗氧化能力,对~(60)COγ射线照射耳蜗损伤有一定的防护作用。

【关键词】：电离辐射 耳蜗 凋亡 活性氧 乙酰半胱氨酸 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 螺旋神经节细胞
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R818;R142
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