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《广西医科大学》 2012年
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左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯体外抗肿瘤效应及其机制初步研究

曾春  
【摘要】:左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯(DMDAI-L)主要以甘露醇为原料合成,属于烷化剂类细胞抑制剂。根据文献报道,DMDAI-L具有明显体内抗肿瘤活性,尤其是对于相对广谱的动物移植性固体及腹水肿瘤均有显著的抑制作用。DMDAI-L的体外抗肿瘤活性目前未见国内外相关文献报道,本课题通过选用多种人肿瘤细胞进行体外筛选实验,研究DMDAI-L的体外抗肿瘤谱及其作用机制。 目的: 1.考察DMDAI-L对多种人肿瘤细胞的增殖抑制作用,初步了解其抗肿瘤谱。 2.通过DMDAI-L对人正常肝细胞、人胚肾细胞的毒性实验,初步考察DMDAI-L的用药安全性。 3.以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,观察DMDAI-L对其的诱导凋亡作用,初步探讨其作用机制。 方法: 1.采用CCK-8法检测不同浓度的DMDAI-L对多种人肿瘤细胞作用不同时间后的增殖抑制活性。 2.同样采用CCK-8法检测不同浓度的DMDAI-L对人正常肝细胞、人胚肾细胞生长的影响。 3.同时给予DMDAI-L以及五种临床上治疗白血病的药物包括顺铂、柔红霉素、阿糖胞苷、环磷酰胺、全反式维甲酸,比较DMDAI-L与这五种药物对HL-60细胞的增殖抑制作用。 4.以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,倒置显微镜观察细胞给药前后的形态改变,并通过Hoechst33258荧光染色法观察凋亡小体形成,同时透射电镜观察凋亡细胞内部结构。 5.通过流式细胞术PI单染法观察不同浓度DMDAI-L对HL-60细胞内DNA含量的影响以分析周期变化;流式细胞术Annexin-V/FITC-PI法检测细胞凋亡率变化。 6.通过酶解可见光底物DEVD-pNA测定给药前后HL-60细胞内的caspase-3酶活性变化。 7.膜电位依赖性结合的荧光探针JC-1标记法观察给药前后HL-60细胞内线粒体膜电位(△Ψm)的荧光变化。 结果: 1. DMDAI-L对所选的多个系统来源的人肿瘤细胞(包括胃肠道、呼吸、生殖系统等)的抑制作用不明显。但是对血液系统来源的HL-60细胞抑制作用十分明显,并呈浓度时间依赖关系。DMDAI-L作用于HL-60细胞24h、48h、72h的IC50分别为57.514±2.089、5.234±0.754.2.451±0.092μg/mL 2. DMDAI-L在体外对人正常肝细胞HL-7702及人胚肾细胞293的生长影响非常小,例如DMDAI-L对人胚肾细胞293作用72h的IC50仅为109.992±0.983μg/mL 3.环磷酰胺及全反式维甲酸作用于HL-60细胞48h的增殖抑制作用不明显,DMDAI-L、柔红霉素、顺铂、阿糖胞苷作用于HL-60细胞48h的IC50分别为5.234±0.754、7.75±0.78、10.86±2.08、38.89±1.02μg/mL 4. Hoechst33258荧光染色分析显示DMDAI-L处理后的HL-60细胞呈现明显的凋亡细胞形态改变;透射电子显微镜观察可见到凋亡细胞皱缩,核染色质呈高度浓缩、边移,胞浆空泡化明显,可见高电子密度的凋亡小体产生。 5. DMDAI-L各剂量组随着作用时间延长,对HL-60细胞周期的影响表现为阻滞细胞于S期及G2/M期;同时,在一定的作用时间内(12h、24h、48h),细胞凋亡率呈明显上升趋势。 6. DMDAI-L各剂量组作用24h,HL-60细胞内的caspase-3酶活性显著上升;在DMDAI-L作用下,随着浓度增加及作用时间延长,HL-60细胞内线粒体膜电位明显降低。 结论: 1. DMDAI-L体外抗肿瘤活性具有一定选择性,对血液系统来源的人原髓细胞白血病细胞HL-60抑制作用明显。 2. DMDAI-L体外对人正常肝细胞HL-7702及人胚肾细胞293的生长影响非常小,初步判断DMDAI-L对人正常肝肾细胞的毒性很低。 3.与全反式维甲酸(ATRA),顺铂(CDDP),阿糖胞苷(ARAC),柔红霉素(DNR),环磷酰胺(CTX)五种临床抗白血病药物相比,DMDAI-L对人原髓细胞白血病HL-60细胞有更强的针对性及较强的增殖抑制作用。 4. DMDAI-L体外可诱导HL-60细胞凋亡,其作用机理可能是:①影响细胞周期分布,阻滞细胞于S期及G2/M期;②在一定剂量范围及作用时间内,激活或调节细胞内的caspase-3酶活性;③降低细胞线粒体膜电位。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R96

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