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《广西医科大学》 2014年
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肺癌干细胞的富集、鉴定及调节Hedgehog信号通路对肺癌干细胞功能的影响

郑晓文  
【摘要】:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是存在于肿瘤细胞中的极小部分细胞,能够驱动肿瘤的持续生长、播散及其后的转移。治疗后残余的CSCs因为耐药而难以被杀死,最终引起肿瘤复发。因此选择性靶向CSCs可为肺癌的诊断和治疗带来巨大的进展。但目前CSCs的分离仍是细胞生物学技术的一个难点,本研究利用CSCs的多重耐药性,以大剂量顺铂短期作用于人肺腺癌A549细胞,在无血清培养基中悬浮成球形培养,体外富集和繁殖LCSCs(lung cancer stem cells,LCSCs),为进一步研究LCSCs的分子生物学功能打下实验基础。同时识别LCSCs的维持和增殖中起作用的分子信号途径,是制定恰当的治疗策略所必需的。Sonic Hedgehog信号通路的激活已经被证实是许多的人类肿瘤及CSCs的维持和增殖中的重要事件,那么SonicHedgehog信号通路在LCSCs中是否也起着重要的作用?具体的机制又如何呢?本文拟对此展开研究。 第一部分人肺腺癌A549细胞中的LCSCs的富集、鉴定 目的:建立人LCSCs的细胞模型,并对其干细胞特性进行鉴定。 方法:选用0、1、2、3、4、5、6、7、8μg/ml顺铂分别作用于人肺腺癌A549细胞,MTT检测细胞增殖抑制率,选用细胞增殖抑制率约70%的顺铂浓度,反复作用A549细胞,获得A549/DDP细胞,继续在无血清培养基(含EGF、bFGF及B27)中悬浮培养,获得富集LCSCs的A549/DDP肿瘤球,鉴定获得的LCSCs的干细胞特性,包括MTT法检测细胞增殖、细胞划痕实验检测细胞迁移能力、RT-PCR检测干细胞基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4的表达,PI染色法测细胞周期,流仪细胞仪检测干细胞表面标记物的表达,裸鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力。 结果:6μg/ml顺铂作用于A549细胞24h后出现大量A549细胞死亡(约70%),残留的细胞经过反复更换新鲜细胞培养液后继续增殖,约一周左右长至90%,反复上述步骤三次后,获得的A549/DDP细胞在无血清培养基中以悬浮状生长,获得A549/DDP肿瘤球,即LCSCs,与A549细胞、A549肿瘤球相比,具有较高的增殖能力、较强的迁移能力;高表达干细胞基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4;细胞周期检测G0/G1期76.8%,S期13.6%,G2/M期10.7%;CD44在A549表达为0.10%,A549肿瘤球(2.68%),在A549/DDP肿瘤球表达量达到92.68%,表达量差异具有统计学意义(p<0.01);CD117在A549细胞表达率为0.32%,在A549/DDP肿瘤球表达率为2.96%,表达量经过药物富集后得到显著增加(p<0.01);A549/DDP肿瘤球的成瘤能力与20倍数量级的A549细胞的成瘤能力相同,高于2倍数量级的A549细胞、A549肿瘤球、A549/DDP细胞的成瘤能力。 结论:1、大剂量顺铂联合无血清培养可以有效富集人肺腺A549细胞中的LCSCs;2、LCSCs具有较强的增殖能力、增加的迁移能力,高表达干细胞相关基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4,G0/G1期细胞比例达76.8%,高表达CD44,并伴随着增强的裸鼠体内成瘤能力。 第二部分Hedgehog信号通路在LCSCs中的作用 目的:探讨Hedgehog信号通路在LCSCs中的作用及其机制。 方法:分别用Hh信号通路抑制剂环巴胺(cyclopamine)及激活剂重组SHH蛋白作用于LCSCs,MTT法检测细胞增殖、细胞划痕实验检测细胞迁移、侵袭实验检测细胞侵袭能力、裸鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力的改变,并分别用ELISA法、明胶酶谱法、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测VEGF、MMP-2、MMP-9的在分泌性水平、活性水平、mRNA及蛋白水平的表达的改变。 结果:1、Hedgehog信号通路主要成份SHH、PTCH1、Gli-1、SMO均在LCSCs中高表达;2、抑制LCSCs中的Hedgehog信号通路可以抑制细胞的增殖、降低细胞迁移侵袭能力、减少成瘤能力,而激活LCSCs中的Hedgehog信号通路则可以促进细胞的增殖、降低细胞迁移侵袭能力、减少成瘤能力;3、抑制LCSCs中的Hedgehog信号通路可以减少LCSCs中的VEGF、MMP-2、MMP-9的表达,反之激活LCSCs中的Hedgehog信号通路可以促进VEGF、MMP-2、MMP-9在LCSCs中的表达。 结论:Hedgehog信号通路成份SHH、PTCH1、SMO、Gli-1在人LCSCs中高表达;Hedgehog信号通路影响人LCSCs的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力;Hedgehog信号通路介导VEGF、MMP-2、MMP-9表达来调节人LCSCs的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力。 第三部分Hedgehog信号通路主要成份在人肺癌组织中的表达 目的:检测Hedgehog信号通路主要成份在人肺癌组织中的表达,并探讨Hedgehog信号通路主要成份与临床病理特征及VEGF、MMP-2、MMP-9表达的相关性。 方法:以72例临床行外科手术切除的肺癌病例为研究对象,收集肺癌组织、癌旁组织,并以50例良性肺病变组织为对照组。并收集患者一般临床资料,包括年龄、性别、吸烟史、TNM分期、疾病分期、病理类型、淋巴结转移、远处转移、分化程度及病理类型等。荧光定量PCR法检测肺癌组织、癌旁组织及良性肺病变组织中Hedgehog信号通路主要成份SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平;免疫组织化学法检测组织中SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的阳性表达;统计学方法分析各因子与临床病理特征的相关性。 结果:1、SHH主要表达在肺癌组织的肿瘤细胞中,亚细胞定位在细胞浆,SHH蛋白在肺癌组织中的阳性表达率为73.6%,SHH的表达与淋巴结转移(P=0.000)、远处转移(P=0.024)、TNM分期(P=0.016)相关;PTCH1主要表达于肺癌组织的细胞核中,PTCH1的表达差异与淋巴结转移(P=0.026)、远处转移(P=0.017)及病理组织类型(P=0.001)相关;SMO阳性表达主要在肺癌组织的肿瘤细胞中,亚细胞定位在细胞膜和细胞浆,SMO的蛋白阳性表达率的不同与淋巴转移(p=0.009)、远处转移(p=0.017)及病理组织学类型(p=0.047)相关;Gli-1在肺癌中主要为胞浆染色,Gli-1的阳性表达率与性别(p=0.000)、吸烟史(p=0.006)、年龄(p=0.031)、淋巴结转移(p=0.033)、远处转移(p=0.014)、分化程度(p=0.002)相关,差异具有统计学意义;VEGF主要表达在胞浆中,VEGF的阳性表达与吸烟史(p=0.029)、淋巴转移(p=0.013)、远处转移(p=0.000)、TNM分期(p=0.000)、疾病分期(p=0.021)、分化程度(p=0.000)、病理类型(p=0.023)相关;MMP-2蛋白主要在肿瘤组织的细胞胞浆内表达,MMP-2的阳性表达与淋巴结转移(p=0.005)、远处转移(p=0.035)、TNM分期(p=0.006)、疾病分期(p=0.006)、分化程度(p=0.013)相关;MMP-9蛋白主要在肿瘤组织的细胞胞浆内表达,MMP-9的阳性表达与性别(p=0.010)、吸烟史(p=0.017)、淋巴结转移(p=0.029)、远处转移(p=0.000)、TNM分期(p=0.001)、疾病分期(p=0.000)、分化程度(p=0.002)相关。2、肺癌组织中的SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白阳性表达率均高于癌旁组织和良性肺病变组织中的表达,差异有统计学意义,分别为p<0.05及p<0.01。3、肺癌组织中SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的蛋白阳性表达与其对应的mRNA表达均具有正相关性(p<0.01)。4、免疫组织化学检测人肺腺癌中配体SHH的表达与受体PTCH1(p=0.000)、膜受体SMO(p=0.015)、转录因子Gli-1(p=0.024)的表达显著性相关,受体PTCH1与受体SMO(p=0.002)、转录因子Gli-1(p=0.042)显著性相关,受体SMO与转录因子Gli-1(p=0.034)显著性相关。5、人肺腺癌组织中的VEGF的表达与Gli-1(p=0.011)的表达显著相关,VEGF的表达与SHH(p=0.563)、SMO(p=0.172)、PTCH1(p=0.807)的表达的相关性不显著;而MMP-2在腺癌组织中的表达与SHH(p=0.000)、SMO(p=0.000)、PTCH1(p=0.000)及Gli-1(p=0.006)的表达显著相关;MMP-9在腺癌组织中的表达与SMO(p=0.000)、PTCH1(p=0.006)及Gli-1(p=0.023)的表达显著相关,而与SHH(p=0.508)的表达相关性不显著。结论:1、SHH、PTCH1、SMO、Gli-1、VEGF、MMP-2、MMP-9在人肺癌组织中的表达均与肺癌的淋巴转移和远处转移相关;2、SHH、PTCH1、SMO、Gli-1、VEGF、MMP-2、MMP-9在肺癌组织的表达均高于癌旁和良性肺病变组织,差异具有统计学意义(P<0.05或p<0.01)3、在人肺腺癌组织中Hh信号通路主要以配体依赖的方式激活,并且通路主要成份之间相互影响表达4、在人肺腺癌组织中Hh信号通路主要成份的表达与VEGF、MMP-2、MMP-9的表达相关。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R734.2

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