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《广西医科大学》 2017年
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SIRT1过表达对THP-1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及作用机制探讨

李登峰  
【摘要】:目的通过构建沉默信息调节因子2-相关酶类-1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1,SIRT1)基因过表达慢病毒载体,体外感染急性髓系白血病THP-1细胞株,研究上调SIRT1基因对THP-1细胞细胞周期、凋亡、增殖等生物学行为的影响及可能的分子机制。方法1.鉴定SIRT1基因过表达慢病毒载体提供目的基因序列信息,由上海吉凯公司协助构建SIRT1基因过表达慢病毒载体并测定病毒滴度。转染293T细胞显微镜观察有绿色荧光,采用实时定量RT-PCR、Western blot方法在m RNA表达及蛋白水平对已构建完成的慢病毒载体进行鉴定。2.过表达慢病毒载体转染THP-1后细胞增殖、周期、凋亡改变使用包装有SIRT1基因的慢病毒转染THP-1细胞,荧光检测,Rt-PCR验证SIRT1基因在m RNA水平的表达,western bloting技术验证SIRT1蛋白表达后,采用CCK-8法绘制基因过表达后细胞生长曲线,流式细胞术检测基因过表达后THP-1细胞的增殖、细胞周期、及细胞凋亡情况。3.检测转染后THP-1细胞恶性细胞行为相关因子实时定量RT-PCR检测sirtuins家族基因;抑癌基因:p21、P53;原癌基因:已知与白血病相关的原癌基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、核因子-κB(Nuclear factorκB,NF-κB);细胞增殖/分化相关因子:粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor,G-CSF)、粒细胞集落刺激因子受体(Granulocyte Colony Stimulating Factor Receptor,G-CSFR)基因、C/EBP-a和C/EBP-β;细胞凋亡相关基因:B细胞淋巴瘤因子2(B cell leukemia/lymphoma 2,Bcl2)、Bcl相关X蛋白(Bcl-associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)3、caspase9基因m RNA的表达情况,WB法检测各组细胞活化型caspase3的蛋白质表达情况。4.统计学分析实验数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,以P0.05有统计学意义,计量资料采用均数±标准差表示,组间差异采用Student t检验或者单因素方差分析(One-Way ANOVA)。不同时间点细胞计数采用一般线性模型的重复测量资料方差分析,对资料进行球形检验,不满足Huynh-Fledt条件时采用Greenhouse-Geisser校正。结果1、过表达慢病毒载体转染293t细胞后,经RT-PCR、western bloting鉴定,m RNA水平检测SIRT1基因表达上调2倍以上,目的蛋白表达显著增高(p0.05),SIRT1基因过表达慢病毒构建成功。2、慢病毒转染MOI为100时,成功建立SIRT1基因过表达THP-1细胞系,RT-PCR及western bloting鉴定m RNA及目的蛋白均显著增高。3、SIRT1基因过表达慢病毒感染THP-1细胞后,其细胞生长曲线与对照组THP-1细胞有明显差异,明显抑制THP-1细胞生长;转染THP-1细胞细胞增殖指数均显著下降,细胞增殖指数显著低于空病毒转染对照组,p值=0.004;SIRT 1慢病毒过表达载体转染THP-1细胞细胞周期发生G1/G0期阻滞;SIRT 1慢病毒过表达载体转染THP-1细胞细胞凋亡率明显升高;4、SIRT1基因过表达THP-1细胞的SIRT1、SIRT3、SIRT4 m RNA表达较空载体con145转染组显著增高(p0.05);Sirt1过表达后,THP-1细胞的凋亡相关基因caspase3的m RNA表达显著增高(p值为0.002)可检出caspase3蛋白表达;THP-1细胞的原癌基因NF-κB下调,且上调THP-1细胞的抑癌基因p21的表达,下调BAX、Bcl2的m RNA表达。结论SIRT1基因过表达慢病毒载体可以通过影响细胞周期调控基因的表达,诱导细胞发生G1/G0期阻滞,明显抑制细胞增殖。可能通过影响细胞凋亡相关因子的表达,影响细胞凋亡信号通路,诱导细胞发生凋亡。SIRT1基因可能在急性髓系白血病中发挥抑癌作用,作用机制可能与细胞增殖、凋亡及周期相关。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R733.7

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【参考文献】
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