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《广西医科大学》 2018年
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miR-182/Sort1在体外和体内调节血管平滑肌细胞钙化的实验研究

张展满  
【摘要】:第一部分Sort1在体外和体内调节血管平滑肌细胞钙化目的:探讨Sort1在AC中的表达,参与调节血管平滑肌细胞钙化。材料和方法:将雄性SD大鼠随机分为钙化组和对照组,每组各10只。钙化组给予大剂量维生素D_3(60万U/kg/天,连续3天)皮下注射诱导大鼠主AC,对照组则给予等量的生理盐水。干预10天后处死大鼠,分离大鼠胸、腹主动脉组织,部分置于4%多聚甲醛固定,用于制作病理切片,其余部分分段保存于液氮中,用于核酸及蛋白检测。苏木精-伊红(HE)染色和钙盐染色(Von Kossa)观察两组大鼠主动脉病理组织结构变化和钙盐沉积情况,qRT-PCR和Western Blot检测中动脉组织中Sort1和RUNX2 mRNA和蛋白表达水平。含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠(β-GP)钙化培养基诱导VSMCs钙化,分为正常组、钙化组,分别培养7天,14天,21天,茜素红S染色观察钙结节形成,检测Sort1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平。慢病毒包装质粒pRsv-REV、pMD2G、pMDLg-pRRE和Sort1沉默载体质粒或对照载体质粒共转染293T细胞,构建慢病毒体系,感染大鼠VSMCs,构建Sort1沉默的细胞稳转株。使用倒置荧光显微镜评价质粒共转染293T细胞效率及慢病毒感染VSMCs情况。10mmol/Lβ-GP钙化培养基诱导VSMCs体外钙化模型,设为钙化组、Sort1沉默组、空白对照组,培养21天。使用茜素红S染色液染色检测各组VSMCs钙化情况,检测Sort1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平。结果:大鼠AC模型建立成功,与对照组大鼠主动脉组织相比,钙化组大鼠动脉正常结构破坏,大量胶原纤维和弹性纤维排列紊乱、出现明显的断裂和降解,中膜弹性纤维间可见大量黑色钙盐沉积;β-GP成功诱导VSMCs钙化,VSMCs钙化组相对于对照组出现明显的橘红色钙盐结节,且随着培养时间的延长,橘红色钙盐结节数量越多,颜色越明显;大鼠VSMCs出现成骨样分化,在体内、体外模型中,RUNX2无论是在基因水平还是蛋白水平,表达量明显增高,随着体外β-GP诱导VSMCs钙化时间的延长,钙盐结节明显增多,RUNX2的表达量也逐渐升高;Sort1基因和蛋白在大鼠体内、体外钙化中的高表达,在体内、体外模型中,钙化组Sort1mRNA和蛋白Sortilin表达水平上调,β-GP诱导VSMCs钙化7天、14天、21天,钙盐结节明显增多,Sort1 mRNA和Sortilin表达量也逐渐升高;Sort1基因在诱导VSMCs钙化及成骨分化过程起到关键作用,慢病毒沉默Sort1基因后,β-GP诱导VSMCs成骨转化及钙化,钙盐结节明显减少,RUNX2表达下调,Sort1通过RUNX2抑制成骨分化及钙化。结论:在大剂量维生素D_3及β-GP可建立大鼠体内体外钙化模型中,Sort1在AC中表达上调,抑制Sort1的表达可抑制VSMCs成骨分化,抑制VSMCs钙化的形成。第二部分miR-182靶向调节Sort1的表达参与动脉钙化的调控目的:探讨miR-182调节Sort1的表达参与动脉钙化的调控材料和方法:应用生物信息学网站miRNAbase、TargetScan预测Sort1是miR-182靶基因,检索miR-182结构;取本实验第一部分的大鼠动脉组织,qRT-PCR检测miR-182在钙化组及对照组中的表达,Pearson相关系数法分析miRNA-182与动脉组织中Sort1 mRNA和蛋白表达水平的相关性。在体外,β-GP钙化培养基诱导VSMCs钙化,7天,14天,21天,检测miRNA-182表达水平;运用miRNA-182 mimic和inhibitor及其相应对照,瞬时转染A7r5大鼠血管平滑肌细胞,过表达和沉默miRNA-182,qRT-PCR和Western Blot分别检测细胞中miRNA-182、Sort1 mRNA和Sortilin表达量的变化。通过载体构建、双荧光素酶检测验证miRNA-182对Sort1靶调控作用。结果:通过mi RNAbase、TargetScan在线数据库查询、分析及预测Sort1是miR-182的靶基因,mi RNA-182的种子序列在多个物种中呈现高度保守性;miRNA-182在大鼠体内钙化动脉组织中的高表达,Pearson相关系数法分析miRNA-182与动脉组织中Sort1 mRNA和Sortilin表达水平的负相关性;在β-GP诱导的体外细胞钙化模型中,miRNA-182在14天后表达量明显低于对照组;miRNA-182 mimic和inhibitor瞬时转染结果显示miRNA-182表达增加或减少能分别减少或增加Sort1蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因验证Sort1是mi RNA-182的靶基因。结论:在大剂量维生素D_3及β-GP可建立大鼠体内体外钙化模型中,miRNA-182在AC中表达下调,过表达或沉默mi RNA-182使Sort1下调或上调,miRNA-182对Sort1具有直接调控作用。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R543.5

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 Francesco Vasuri;Silvia Fittipaldi;Gianandrea Pasquinelli;;Arterial calcification: Finger-pointing at resident and circulating stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2014年05期
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1 Suzuki J;Meoli DF;Matoba T;Berk BC;谢闵;;Cyclophilin A在血管平滑肌细胞中经囊状途径分泌[J];中国动脉硬化杂志;2006年05期
2 卢坤平,赵升皓,王道生;钙和钙调素与血管平滑肌细胞的增殖[J];中国药理学与毒理学杂志;1988年03期
3 梁明达;邱殷庆;;人血管平滑肌细胞系的建立及其特性[J];云南医药;1988年03期
4 王玉美;;发现一种新神经递质:内皮-衍生松弛素[J];生理科学进展;1989年04期
5 任安民;戴秋艳;;血管平滑肌细胞对动脉粥样硬化形成的作用研究[J];国际心血管病杂志;2017年05期
6 王翔飞;葛均波;孙爱军;徐丹令;王克强;;大黄素自身抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖[J];中国介入心脏病学杂志;2006年04期
7 王启贤,周兰清,赵媛,吕俊升;凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞血小板源生长因子受体基因表达的影响[J];中国动脉硬化杂志;2001年03期
8 王启贤,吕俊升;凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响[J];中国动脉硬化杂志;2000年01期
9 张茜;血管紧张素Ⅱ受体与血管平滑肌细胞的增生、肥大[J];高血压杂志;1997年01期
10 许国双;刘安;;有机阴离子转运蛋白1在人血管平滑肌细胞表达的意义[J];医学临床研究;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈华;刘伟;程洁;李玲芳;邬国军;;人巨细胞病毒感染对血管平滑肌细胞MMP-2表达的影响[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年
2 刘建平;何国祥;唐波;景涛;;电场干预对血管平滑肌细胞表面血小板衍化生长因子受体分布的影响[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年
3 刘建平;唐波;何国祥;;直流电场影响血管平滑肌细胞迁移和增殖的实验研究[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年
4 王宁宁;王笑云;何东元;熊明霞;张飞飞;杨俊伟;;体外高磷诱导人血管平滑肌细胞钙化的作用研究[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
5 赵瑾;迟路湘;诸兴明;;兔颈动脉粥样硬化斑块形成过程中血管平滑肌细胞功能变化的动态观察[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
6 余惠珍;谢良地;朱鹏立;;人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
7 唐波;何国祥;刘建平;李德;;血管平滑肌细胞受电场作用后迁移的变化[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年
8 唐波;何国祥;刘建平;李德;;电场干预对血管平滑肌细胞形态和细胞骨架的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年
9 唐波;刘建平;何国祥;李德;;直流电场对大鼠血管平滑肌细胞骨架分布的作用[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年
10 唐波;刘建平;何国祥;李德;;直流电场对血管平滑肌细胞迁移的影响[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年
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1 张诚;选择有挑战性的研究课题[N];科技日报;2005年
2 中国医学科学院药用植物研究所研究员 郭伽;硫化氢具有重要的生理功能[N];健康报;2009年
3 方雪;四种有益健康的好行为[N];民族医药报;2007年
4 记者 杨凤;稳定动脉粥样硬化斑块有新靶点[N];健康报;2014年
5 第四军医大学西京医院 教授 裴国献 吴一福;综合补钙效果佳[N];家庭医生报;2010年
6 本报记者  王华锋;今年花开别样红[N];中国医药报;2006年
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1 于媛;circ-Sirt1上调血管平滑肌细胞SIRT1表达的机制及意义[D];河北医科大学;2018年
2 石瑜;HTRA1基因突变对血管平滑肌细胞功能的影响及其与氧化还原反应关系研究[D];第二军医大学;2015年
3 刘海伟;CREG表达调控人血管平滑肌细胞HITASY表型转换机制研究[D];第四军医大学;2004年
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5 马瑞;睾酮对血管平滑肌细胞中雄激素受体表达调控的研究[D];第一军医大学;2004年
6 唐波;外加电场干预对体外培养大鼠血管平滑肌细胞部分生物学行为的影响[D];第三军医大学;2004年
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1 刘梦;金属蛋白酶ADAMTS18在血管平滑肌细胞表型转化中的作用研究[D];华东师范大学;2018年
2 刘超研;p22phox通过上调KLF4的表达促进Ang-Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转换[D];南华大学;2018年
3 张展满;miR-182/Sort1在体外和体内调节血管平滑肌细胞钙化的实验研究[D];广西医科大学;2018年
4 秦梦杰;MYL9在动脉粥样硬化病变演进中的作用[D];大连医科大学;2018年
5 王雪琴;MiR-4463在动脉硬化闭塞症中介导JNK通路对血管平滑肌细胞的机制研究[D];西南医科大学;2018年
6 张波;SRFBP1对血管平滑肌细胞表型转换的调控机制[D];山东师范大学;2018年
7 田恬;间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制研究[D];河北医科大学;2017年
8 付芬;硒蛋白S对过氧化氢诱导的血管平滑肌细胞向成骨细胞分化及相关信号转导途径的影响[D];华中科技大学;2016年
9 刘霞;突变心钠肽对血管平滑肌细胞的影响[D];华中科技大学;2016年
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