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《广西医科大学》 2017年
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脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片生物学特性研究

孙珍珠  
【摘要】:小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa,SIS)是一种天然的细胞外基质,主要成分是胶原蛋白。SIS经加工后制成的修复材料具有良好的生物相容性、适当的降解性、低或无免疫原性、一定的机械强度等特性。目前,SIS修复材料广泛用于血管、膀胱、肠道、肌腱以及泌尿系统等组织修复中。本研究所采用的脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片是由猪小肠粘膜下层经脱细胞、冻干、灭菌等工艺制成,临床上拟通过长期植入体内修复疝气、肛瘘等部位软组织的损伤。本研究针对脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片生物学特性中的降解规律和免疫毒性两方面进行临床前研究,为其更安全、有效的应用提供理论依据。(1)为了更加可靠地研究脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片的免疫毒性,本研究利用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)优化大鼠免疫刺激模型,为其免疫毒性研究设立免疫刺激组。选取Wistar大鼠42只,随机分为空白对照组、假手术组、免疫抑制组、LPS给药后6h组、LPS给药后12h组、LPS给药后24h组和LPS给药后48h组。对大鼠进行给药处理后取材并检测以下指标:大鼠体重变化、免疫器官系数、血液学参数、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖、细胞因子(IL-1β和TNF-α)含量。结果显示,LPS给药后6h、12h组在免疫器官系数、血液学参数、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖、细胞因子含量方面均出现一定的免疫刺激现象,与空白对照组、假手术组比较存在显著性差异(p0.05),而12h组的免疫刺激现象更加明显。LPS给药后24h、48h组的免疫刺激现象不明显;免疫抑制组在免疫器官系数、血液学参数、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖、细胞因子含量等方面均出现一定的免疫抑制现象,与空白对照组、假手术组比较存在显著性差异(p0.05)。上述结果说明,大鼠腹腔注射LPS后12h的免疫刺激现象最明显,可作为大鼠免疫刺激模型用于脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片的免疫毒性研究中。(2)本研究对脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片的免疫毒性进行了探讨。选取Wistar大鼠80只,随机分为高剂量组、低剂量组、假手术对照组、免疫抑制组和免疫刺激组,依据考察周期将每组16只大鼠再随机分为1、4、8和12周4个实验操作小组(n=4)。对大鼠进行埋植/给药处理后取材并检测以下指标:大鼠体重变化、免疫器官系数、血液学参数、免疫器官病理学、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群、淋巴细胞增殖、补体C3蛋白含量、免疫球蛋白(IgG、IgM)含量、细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量。结果显示,第1、4、8和12周的各时间点,高剂量组、低剂量组与假手术对照组在大鼠体重变化、血液学参数、免疫器官系数分析、免疫器官病理学分析、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖试验、免疫球蛋白含量、细胞因子含量的测定方面变化趋势基本一致,各组数据间相比不存在显著性差异(p0.05);高剂量组和低剂量组在NK细胞杀伤活性和补体C3含量测定方面与假手术对照组有一定差异。免疫刺激组大鼠在血液学参数、免疫器官系数分析、免疫器官病理学检查、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖方面出现一定的免疫刺激现象,与高剂量组、低剂量组、假手术对照组比较有显著性差异(p0.05);免疫抑制组大鼠在血液学参数、免疫器官系数分析、免疫器官病理学检查、T淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞增殖方面出现不同程度的免疫抑制现象,与高剂量组、低剂量组、假手术对照组比较有显著性差异(p0.05)。以上结果说明,大鼠腹部皮下埋植脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片后未见明显的免疫毒性反应。(3)本研究从体外降解和体内降解两方面对脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片的降解规律进行研究。体外降解包括加速降解和常规降解两方面。其中加速降解是在0.5mg/mL的Ⅰ型胶原酶中震荡进行,于不同时间点取出样品碎片,计算其降解率。结果显示,随着时间的延长,脱细胞猪小肠粘膜疝修补片在0.5mg/mL的Ⅰ型胶原酶中逐渐降解,酶解20h降解率达到68%左右,此前的降解率均低于相同时间点下COOK~?疝修补片的降解率,此后二者降解率接近,至96h降解率均90%以上。常规降解是在0.01M PBS中静置进行,于不同时间点取出样品碎片,计算其降解率。结果显示,脱细胞猪小肠粘膜疝修补片静置30d时几乎未发生降解,此后随着时间的延长,逐渐降解,至静置180d时,降解率达到90%以上。体内降解的体内埋植实验跟免疫毒性研究的埋植实验同步进行,分别于大鼠腹部皮下植入脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片后1周、4周、8周和12周对其进行埋植部位大体观察和组织学观察。结果发现,埋植部位大体观察,随着植入周期的延长,第1、4、8周的脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片不断被结缔组织包裹,并逐渐降解吸收,至植入12周脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片与周围结缔组织完全融合。组织学观察,随着植入周期的延长,第1、4、8周的脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片逐渐与周围结缔组织融合,炎症细胞逐渐减少,至植入12周该材料与周围结缔组织基本融合,局部仅见少量散在炎症细胞浸润,未见明显炎症病变。大鼠皮下植入脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片12周时,皮下脱细胞猪小肠粘膜下层疝修补片基本完全降解。降解实验结果说明,脱细胞猪小肠粘膜疝修补片具有适当的生物降解性。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R318.08

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