收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

生精细胞体外培养的研究

檀大羡  
【摘要】:本研究的目的是通过动物实验探讨生精细胞(spermatogenic cell)的分离方法、生精细胞体外培养过程中添加睾酮的浓度和与支持细胞(Sertoli cell)共同培养(coculture)的条件、生精细胞发育阶段的鉴定方法,以及精子细胞体外培养的条件,在此实验基础上研究人类生精细胞的体外培养,为解决无精子症(azoospermia)患者的治疗奠定理论基础和实验方法。 本研究分动物实验和人类生精细胞培养两阶段进行。 第一阶段动物实验包括五个实验内容。 实验一探讨大鼠生精细胞分离的方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法(combination of enzymatic digestion)等三种方法分离睾丸组织,分别对分离出的细胞总数、分离所需的时间、活细胞率等项目进行比较。结果三种分离方法中以组合酶法得到的细胞总数最多、活细胞率最高、分离所需时间最短(P<0.05)。检测培养48h的分离的细胞存活率,结果用组合酶法制备的细胞的存活率比其他两种分离方法高(P<0.05),但培养过程中细胞死亡率比其他两组高,而在统计学上无显著性差异(P>0.05)。 实验二生精细胞体外培养过程中添加不同浓度睾酮(testosterone,T)的研究:在培养液中添加睾酮,设T_0、T_1、T_2、T_3四组,添加睾酮的浓度分别为0ng/ml、340ng/ml、1700ng/ml、3400ng/ml,各组均加入卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)(50IU/L)。观察生精细胞体外培养的生长行为和培养前与培养后不同培养时间内细胞的存活率以及生精细胞的体外分化情况。结果生精细胞在体外培养过程中添加不同浓度的睾酮对细胞的存活率影响不大,但对细胞的分化和成熟有比较明显的影响,T_2组的生精细胞在体外培养中的生长状态较好,初级精母细胞分化为早期精子细胞的数量均比其他三组多(P<0.01)。 实验三生精细胞与支持细胞共培养条件的研究:本实验在生精细胞与支持细胞共培养的基础上,设计三种不同的培养条件:第一组采用DMEM/F12作为基础培养液,添加其他成分;第二组在第一组条件的基础上,以非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)为饲养细胞;第三组采用改良人类输卵管液作为基础培养液并添加其他成分。通过观察在这三种不同培养条件下生精细胞体外共 广西医科大学硕士学位论文生精细胞体外培养的研究 培养的生长行为、培养前与培养后不同时间内细胞的存活率以及生精细胞体 外分化情况,进行统计学分析比较。结果各实验组生精细胞均能从初级精母 细胞阶段分化到精子细胞阶段,其中第二组生精细胞在体外培养中的生长状 态、细胞存活率及初级精母细胞分化为精子细胞的数量均优于第一组和第三 组(P0.01);第二、第三组的精子细胞能进一步成熟到sbl、SbZ期精子细胞, 但以第二组较好,在统计学上有显著性差异(P0.01),第一组未见有SbZ期 精子细胞生成。 实验四生精细胞体外培养的鉴定方法:采用5一澳一2一脱氧尿昔(5一bromo一2- deoxyUridine,BRD功标记免疫细胞化学法和流式细胞分析(fl ow cytometry, FCM)两种检测技术。在实验前9天用BRDU注入大鼠腹腔,在体内标记大鼠 生精细胞的DNA,通过免疫细胞化学法检测培养前的初级精母细胞,证实 BRDU己在初级精母细胞中显示,培养4一6天后可观察到有BRDU标记的次 级精母细胞,8一12天有BRDU标记的圆形精子细胞出现.FCM检测生精细胞 培养前后倍体的变化结果显示,培养后单倍体精子细胞峰值较培养前增高。 实验五精子细胞体外培养的研究:将精子细胞置于四种不同的条件下进 行培养,观察精子细胞在培养过程中的生长行为及其成熟情况。结果在有Vero 细胞饲养条件下培养,精子细胞与支持细胞共培养组和精子细胞单独培养组 的生长状态较好,精子细胞的成熟率分别为(6 .54士1 .71)%和(3 .25士0.50)%, 均高于单纯用改良人类输卵管液条件下精子细胞与支持细胞共培养和单独培 养的成熟率伊0.05)o 第二阶段人类生精细胞体外培养的初步研究:以改良人类输卵管液或 DMEMIF 12(以vero细胞为饲养细胞)为基础培养液,将4例患者的辜丸组织 分离成生精细胞混悬液,用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细 胞和精子细胞单独培养,观察培养前后生精细胞的分化、成熟情况。结果显 示:4例患者辜丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟,初级精 母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为0 .47%一1 .50%;Sa期精子细胞能进 一步变形、成熟为Sb、sc期精子细胞,成熟率为0.93%~5 .72%。 通过以上实验研究,得出如下结论:①在攀丸组织的分离方法中,用组 合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的各级生精 细胞和支持细胞;②生精细胞培养过程中添加辜酮的浓度为1700ngl而时比较 合适;③在生精细胞与支持细胞共培养过程中以砚m细胞为饲养细胞能为生 广西医科大学硕士学位论文生精细胞体外培养的研究 精细胞的生长和分化提供更好的培养条件,改良人类输卵管液比DMEM邓12 培养液更适合生精细胞的体外成熟;④BRDU标记及FCM检测能比较准确地 反映生精细胞在体外培养过程中从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段的 分化情况;⑤早期精子细胞经体?


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 高长杰;精液生精细胞检查鉴别诊断无精子症[J];中华男科学;2000年03期
2 曹育爱,金合武,曹兴午,杨文质;70例无精子症生精细胞检出与病因分析[J];中国性科学;2004年01期
3 张曲涛,常剑锋,戈一峰;无精子症病人性激素测定和精液细胞学检查[J];中华男科学;2002年03期
4 苏华;支持细胞在睾丸局部调节中的作用[J];生殖与避孕;1989年02期
5 彭弋峰,徐东亮,仲皖,卢林明,陆仁康;Fas和FasL系统在非梗阻性无精子症睾丸中的表达[J];临床泌尿外科杂志;2004年02期
6 陈万新,晏想成,刘军,樊丽华,彭孝敬;针吸细胞学检查对无精子症睾丸生精状况的评价[J];华中医学杂志;1994年03期
7 沈凯;睾丸支持细胞和间质细胞在生精细胞凋亡中的作用[J];国外医学.泌尿系统分册;1997年04期
8 刘西和,张丽,白璐;无精子症病人性激素测定和精液细胞学检查[J];牡丹江医学院学报;2004年05期
9 张德迎;何大维;魏光辉;宋晓峰;李旭良;林涛;;精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养(英文)[J];四川大学学报(医学版);2008年01期
10 吴东;无精子症患者两侧睾丸活组织检查比较[J];临床泌尿外科杂志;1994年02期
11 李俊君;朱江宁;秦淑芳;;28例无精子症病人睾丸活检病理特征分析[J];宁夏医学杂志;2007年06期
12 何尚宽;无精子症(250例病因分析)[J];解剖学研究;1989年02期
13 曹兴午,曹育爱,金合武;睾丸性生殖障碍——曲细精管界膜病变[J];中国性科学;2002年02期
14 杨庆媛,张建平;临床无精子症的睾丸活检病理分析及免疫组化研究[J];济宁医学院学报;2004年01期
15 沙国柱,肖景珠,黄宇烽,张连贵,徐建平,戚大梁,商学军,毛锡智;精液、睾丸针吸细胞学与睾丸活检的相关性[J];男科学报;1996年02期
16 吕伟宏;田怀军;;低氧对大鼠睾丸支持细胞形态结构与存活率的影响[J];第三军医大学学报;2007年01期
17 赵信喜;;无精子症的睾丸针吸细胞学探讨[J];医药论坛杂志;2007年11期
18 沈美玲;;人类生精细胞凋亡的调控因素[J];山东医学高等专科学校学报;2009年03期
19 蔡文娟;谷翊群;;抑制素B对精子发生障碍的诊断参考价值[J];国际生殖健康/计划生育杂志;2009年06期
20 张志文,李伟雄;抑素[J];生理科学进展;1982年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张燕君;杜一;王登宇;崔海音;孙冰玉;孔维华;;前列腺素E合成酶cPGES在小鼠睾丸中的表达及热激后变化[A];2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
2 卞廷松;赖仁胜;徐福松;朱长乐;;睾丸生精障碍性不育症患者的生精细胞凋亡实验研究[A];新编男科理论与临床——中华中医药学会第七届中医男科学术大会;全国中医男科临床与科研方法高级研修班;2006年云南省中医男科诊疗技术培训班讲义与论文集[C];2006年
3 檀大羡;王植柔;;大鼠生精细胞体外培养的研究[A];21世纪男科学——中华医学会第五次全国男科学学术会议论文集[C];2004年
4 孙国波;;白消安诱发建立鸡无精子症模型的研究[A];中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集[C];2009年
5 那万里;刘凯峰;侯毅;;无精子症病人血清性激素测定和精液细胞学检查[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
6 吴盼;季宇彬;郎朗;;线粒体对生精细胞凋亡的调控[A];中国药理学会第六届生殖药理学专业学术研讨会论文摘要汇编[C];2009年
7 陈淑玲;;无精子症的临床分析[A];第一届全国中西医结合男科学术会议论文汇编[C];2001年
8 宋博;蔡志明;;采用他莫西芬-十一酸睾酮联合治疗严重少(弱)精子症、分泌型无精子症报道[A];第七次全国中西医结合男科学术会议及全国中西医结合男科提高班论文汇编及讲义[C];2011年
9 季宇彬;吴盼;郎朗;;线粒体对生精细胞凋亡的调控[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年
10 金保方;张华俊;杨晓玉;张新东;周玉春;刘建国;薛宇阳;;养精胶囊治疗DAZ基因缺失所致无精子症的临床价值[A];第七次全国中西医结合男科学术会议及全国中西医结合男科提高班论文汇编及讲义[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐健;小鼠睾丸生殖细胞凋亡及相关基因调控的研究[D];中国协和医科大学;1999年
2 张勇;缺氧对于大鼠原代支持细胞的损伤作用和机制研究[D];华中科技大学;2013年
3 周德荣;棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达的调节作用的研究[D];汕头大学;2009年
4 王涛;TLR3在小鼠生精细胞中的表达及功能[D];北京协和医学院;2012年
5 王岚;合并应用棉酚与甾体激素的雄性抗生育机理和遗传安全性研究[D];中国协和医科大学;2002年
6 俞作仁;小鼠精子发生不同阶段生精细胞基因表达谱的研究[D];中国协和医科大学;2003年
7 霍然;人睾丸蛋白质表达谱的构建及精子发生相关蛋白质组学研究[D];南京医科大学;2006年
8 向延芳;靶向干扰Sertoli细胞功能的避孕蛋白在毕赤酵母中的表达及活性的研究[D];第三军医大学;2008年
9 周莉;羟基脲诱导的生精细胞凋亡及其作用机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
10 陈雪梅;邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对雄性大鼠的联合生殖毒性研究[D];重庆医科大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 檀大羡;生精细胞体外培养的研究[D];广西医科大学;2004年
2 邹海军;成年公兔生精细胞和支持细胞的纯化及体外培养[D];扬州大学;2007年
3 徐会茹;抗FSH自身抗体对雄性生殖系统的影响及其作用机制的初步研究[D];南京师范大学;2007年
4 谭俊玲;小鼠生精细胞与支持细胞自噬与自噬诱因的初步研究[D];山东大学;2013年
5 覃兆鲜;水牛生精上皮细胞体外培养的初步研究[D];广西大学;2008年
6 杨蓓;支持细胞诱导骨髓干细胞向精原细胞分化的研究[D];南昌大学;2007年
7 孙静波;不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应[D];安徽医科大学;2011年
8 裴洪岗;黄芪对隐睾大鼠生精细胞凋亡的作用[D];江西医学院;2004年
9 李桂玲;槲皮素对己烯雌酚致仓鼠生精损害的缓解作用[D];河北农业大学;2010年
10 张波;超声靶向微泡破坏对支持细胞的生物学效应研究[D];重庆医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 南京医科大学附属南京市妇幼保健院泌尿男科 潘连军 博士;尿不湿会引发不育?[N];健康时报;2010年
2 ;无精子症的分类及病因[N];人民日报海外版;2004年
3 平治;无精子症也有希望[N];山西科技报;2000年
4 副主任医师 李秋菊;无精子症如何治疗[N];医药养生保健报;2009年
5 祝之;治无精子症方[N];民族医药报;2004年
6 陈武山;中医辨治男性不育症[N];家庭医生报;2007年
7 宁静;肾炎会引起无精子吗[N];大众卫生报;2005年
8 沈振东;五种病症影响男性生育[N];医药养生保健报;2006年
9 田福兆;杀伤精子的四大元凶[N];农村医药报(汉);2006年
10 本报记者 王文郁;试管婴儿让不孕夫妇圆梦[N];中国消费者报;2000年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978