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《广西医科大学》 2007年
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脂质体转染反义寡核苷酸对体外培养重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的调控作用

刘容容  
【摘要】: β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病,是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止,这不仅使患者血红蛋白水平降低,而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩,这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体,它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞寿命缩短,引起了严重的溶血性贫血。因此,抑制内源性α-珠蛋白基因表达,减少肽链的比例失衡可能成为β-地中海贫血基因治疗的新策略。反义技术可通过反义寡核苷酸(ASON)结合特异的靶基因达到下调基因表达的目的。已有研究者通过应用ASON纠正β-珠蛋白基因突变达到治疗β-地中海贫血的目的。但以α-珠蛋白基因为靶目标,通过ASON下调其表达的研究尚未见报道。 本研究探讨ASON对重型β-地中海贫血α-珠蛋白的作用。研究分为三个部分。第一部分,建立了一步法红系细胞体外液体培养体系,为后期的研究提供重要的实验条件。第二部分,通过脂质体转染作用于K562细胞,筛选获得高效抑制α-珠蛋白基因表达的ASON及最佳作用浓度。第三部分,观察了脂质体转染高效ASON对体外培养的重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的调控作用。本研究侧重于在分子水平调控β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的合成,改善红系细胞内珠蛋白比例的失衡,寻求反义技术治疗β-地中海贫血的新思路。 1.方法 1.1建立一步法红系细胞体外液体培养体系,通过观察细胞形态特征,分析红系造血祖细胞集落形成能力;流式细胞仪检测表达血型糖蛋白A(GLA)的红系细胞比例;高效液相法测定血红蛋白表达,了解红系细胞生长分化的过程。 1.2依据RNA二级结构,通过计算机软件预测设计靶向α-珠蛋白基因不同位点的ASON。经脂质体转染稳定表达α-珠蛋白基因的K562细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量RT-PCR检测寡核苷酸作用后K562细胞α-珠蛋白基因表达量,Cell CountingKit-8(CCK-8)法观察细胞增殖情况,分别筛选抑制α-珠蛋白基因表达的高效ASON及最佳的ASON作用浓度。 1.3应用实时荧光定量RT-PCR检测正常人及重型β-地中海贫血患者的α、β、γ-珠蛋白基因的表达,以了解α-与β-、γ-基因的比例。经脂质体转染高效ASON作用于体外培养的重型β-地中海贫血红系细胞,通过实时荧光定量RT-PCR及高效液相法检测观察脂质体转染ASON对α-珠蛋白基因表达及血红蛋白合成的影响。此外,通过电镜观察ASON作用前后红系细胞内过剩α-珠蛋白肽链沉积的改变情况,客观分析ASON对α-珠蛋白肽链的调控作用。 2.结果 2.1一步法体外液体培养体系中红系祖细胞可逐渐生长分化成为成熟细胞。形态学证实培养细胞逐渐由原始红细胞向成熟红细胞分化;BFU-E和CFU-E生长高峰分别出现在一步法体外液体培养的第4、8天;培养细胞的GLA~+表达水平逐渐增高,培养0天、4天、8天、12天的GLA~+表达率分别为10.7%,22.5%,89.0%,98.3%;培养细胞的HbF量从0天的0.5%增至第12天的11%(P<0.01)。 2.2筛选获得高效抑制α-珠蛋白基因表达的ASON及最佳的ASON作用浓度。脂质体对K562细胞有较高的转染效率,作用24h、48h、72h的转染效率分别为62.3%,38.4%,25.8%。依据计算机软件预测结果分别针对α-珠蛋白基因的翻译起始区和编码区设计了4条ASON,其中靶向翻译起始区,长度为20bp的ASON能高效抑制该基因表达,并且抑制效应呈浓度及时间依赖性:0.25μmol/L、0.50μmol/L的ASON组转染不同时段后α-珠蛋白基因相对表达水平分别为:0.35±0.01、0.25±0.01(转染24h后);0.24±0.01、0.21±0.01(转染48h后)(P均<0.01)。脂质体转染寡核苷酸对K562细胞增殖有明显的抑制作用,浓度为0.50μmol/L的ASON组对K562细胞生长抑制率(%)最高为83.32±0.75(P<0.01),最终选取0.25μmol/L作为ASON最适宜的作用浓度。 2.3与正常人比较,重型β-地中海贫血患者α/β+γ的比例明显失衡。 α/β+γ比值在正常人和重型β-地中海贫血患者分别为1.11±0.07、2.22±0.25(P<0.01)。脂质体转染高效ASON能明显抑制培养的重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白基因表达,空白对照组和ASON组的α-珠蛋白基因mRNA分别为24.23±0.29,9.04±0.29(P<0.01);同时,ASON改善了α/β+γ比例失衡,该比值在空白对照组和ASON组分别为2.26±0.06,0.79±0.02(P<0.01)。ASON作用后重型β-地中海贫血红系细胞HbF由0天的25.50±0.28增至第12天的66.05±3.32,空白对照组HbF为35.25±3.04。此外,透射电镜结果也证实ASON组中红系细胞内过剩α-珠蛋白肽链沉积有所减少,特别是在早期幼红细胞中;在空白对照组中沉积物无任何变化。 3.结论 我们选择α-珠蛋白肽链作为实验对象,设计并筛选了抑制α-珠蛋白基因表达的高效ASON及适宜的作用浓度,应用该ASON抑制了一步法体外液体培养体系中重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白基因表达,改善了珠蛋白基因α/β+γ比例的失衡,减少了过剩α-珠蛋白肽链在红系细胞内的沉积。本研究结果在国内外尚属首次报道。理论上,有助于减轻过剩α-珠蛋白肽链及其降解产物沉积所致红细胞破坏,可能有助于延长病变红细胞的寿命,减少溶血,这对治疗β-地中海贫血具有重要意义,也为基因治疗β-地中海贫血提供了一个新的思路。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R556

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