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《广西医科大学》 2008年
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冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

倪玉霞  
【摘要】: 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和体外体内的示踪研究 实验一大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 目的培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打下基础。 方法取SD大鼠双侧股骨骨髓,分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法(应用60%PERCOLL淋巴细胞分离液)培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行传代、扩增,对细胞的形态学及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定。 结果两种方法培养的细胞均为成纤维细胞样,集落生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%)和CD11b-(87.6%);梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%)和CD11b-(96%)。全骨髓贴壁培养简单易行,原代培养周期较短,但密度梯度离心法培养的BMSCs更加纯化。 结论两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,造血干细胞和内皮细胞表面标志抗原CD34、CD45、CD11b均表达阴性,间充质干细胞表面标志抗原CD44、CD29、CD90均表达阳性,这些细胞可用于进一步的实验。 实验二CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞体外体内的示踪研究 目的建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察,为进一步的研究提供依据。 方法应用CM-DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs,应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察;8只SD大鼠,制作急性心肌梗死模型,将已标记CM-DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠,在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片,并在荧光显微镜下观察移植细胞;于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43(connexin43)的表达。 结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100%,标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响,形态无改变,经过传代培养14天仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周,心肌组织冰冻切片可找到移植细胞,CM-DiI与BMSCs结合稳定,荧光标记效果维持一个月无明显衰退,免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。 结论CM-DiI细胞标记液标SEBMSCs,对细胞生长特性无影响,操作简单,标记效果好,BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活,并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM-DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。 第二部分冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死的影响 目的本实验通过观察冠心Ⅱ号联合BMSCs移植对大鼠急性心肌梗死模型心功能、血管再生和心肌纤维化的影响,并与单纯BMSCs移植比较,探讨冠心Ⅱ号和BMSCs移植对急性心肌梗死是否有协同治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨,为冠心Ⅱ号在提高干细胞移植治疗心肌梗死疗效方面的应用提供依据。 方法74只SD大鼠随机分为5个实验组:(1)正常对照组(n=10):不制作心肌梗死模型,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(2)模型组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养基,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(3)冠心Ⅱ号组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养基,用冠心Ⅱ号汤剂(相当于生药10g/kg体重)灌胃,1次/天,共一周。(4)BMSCs组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射2×10~6个已标记CM-DiI的BMSCs,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(5)冠心Ⅱ号+BMSCs组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射2×10~6个已标记CM-DiI的BMSCs,用冠心Ⅱ号汤剂(相当于生药10g/kg体重)灌胃,1次/天,共一周。 4周后,进行如下检测:(1)多普勒超声心动图检测心功能,记录左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。(2)Masson三色染色法检测左心室心肌纤维化改变;(3)心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察移植的BMSCs。(4)免疫组织化学法检测心梗边缘区组织VWF和VEGF的表达,计算心肌微血管密度。(5)荧光定量RT-PCR检测心肌梗死边缘区TGFβ1mRNA、VEGF mRNA的表达水平。(6)酶联免疫吸附法检测血清中Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)的浓度。 结果(1)各组死亡例数:模型组4例,冠心Ⅱ号组3例,MSCs组4例,冠心Ⅱ号+MSCs组3例。4组比较无显著差异(P>0.05)。最终进入心功能检测的动物为60例,正常对照组10例,模型组12例,冠心Ⅱ号组13例,MSCs组12例,冠心Ⅱ号+MSCs组13例。(2)心功能比较:心梗后4周,除正常对照组外,其余组别大鼠均出现不同程度心脏室壁收缩幅度降低,左室前壁无运动或运动减弱,射血分数及左室短轴缩短率降低,心腔不同程度扩张,以模型组最为严重。模型组、冠心Ⅱ号组、BMSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组的LVIDd、LVIDs、FS、EF与正常对照组比较,均有显著统计学意义(P<0.01);三组治疗组与模型组比较,LVIDd和LVIDs明显缩短(P<0.05,P<0.01),心功能明显改善(P<0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组与MSCs组相比较,LVIDs显著缩短(P<0.05),FS明显提高(P<0.01),EF也显著提高(P<0.05)。(3)Masson三色染色切片显示,正常对照组未见梗死灶和纤维形成,心肌排列整齐,其余各组均出现大小不等的心肌梗死灶,被染成蓝色的胶原纤维增生代替梗死区域,形成瘢痕,梗死区域室壁变薄。胶原含量及纤维化程度依次为:模型组>冠心Ⅱ号组>MSCs组>冠心Ⅱ号+BMSCs组。(4)MSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组左心室心肌梗死边缘区组织冰冻切片,荧光显微镜下均可找到发出红色荧光的移植细胞。其余各组未见阳性细胞。(5)在三个治疗组,均可见到VWF、VEGF表达增多,并可见新生血管形成。与正常对照组相比,各组的VEGF表达增强,MVD显著增加(P<0.01);各治疗组与模型组相比较,VEGF表达增强,MVD增加,均有显著性差异(P<0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组与BMSCs组比较,VEGF表达和MVD均有显著性差异(P<0.01)。(6)各个心梗造模组心肌组织TGFmRNA、VEGFmRNA表达水平均显著高于正常对照组(P<0.01);三个治疗组TGFβ1mRNA表达水平低于模型组(P<0.01),VEGFmRNA表达水平高于模型组(P<0.01);与BMSCs组比较,冠心Ⅱ号+BMSCs组TGFβ1mRNA表达水平较低((P<0.05),VEGFmRNA表达水平较高(P<0.01)。(7)心肌梗死造模后,血清PⅠCP、PⅢNP水平均显著性升高,显示体内的Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成增加。与模型组相比,冠心Ⅱ号组、BMSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组血清PⅠCP、PⅢNP水平均有显著性降低(P<0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组血清PⅠCP、PⅢNP水平和冠心Ⅱ号组、BMSCs组相比较,均有显著下降(P<0.01)。表明冠心Ⅱ号联合BMSCs移植可有效减少心肌梗死区胶原合成,减少了PⅠCP、PⅢNP的释放。 结论(1)冠心Ⅱ号汤剂、BMSCs移植和冠心Ⅱ号联合BMSCs移植等3种方法均可改善心肌梗死大鼠心功能,减少心室扩张程度,但以联合组效果最佳。冠心Ⅱ号和BMSCs移植对心肌梗死有协同治疗作用。(2)冠心Ⅱ号汤剂、BMSCs移植和冠心Ⅱ号联合BMSCs移植等3种方法均可促进心肌梗死后新生血管形成,而冠心Ⅱ号可促进BMSCs移植后的血管新生,增加移植细胞区域的血供,改善了移植细胞的生存环境。这可能与其促进VEGF分泌和上调VEGF基因的表达有关。(3)3个治疗组均可减少心梗后胶原形成,减少心肌纤维化,减轻心室重塑,但以冠心Ⅱ号联合BMSCs移植组效果最佳,可能与下调TGFβ1基因的表达有关。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R542.22

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