胸腔积液CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞上调及其机制

【摘要】： 正常机体胸膜腔内的液体分泌和吸收保持着动态平衡，任何病理原因加速其产生和(或)减少其吸收时，就会出现胸腔积液。渗出性胸腔积液最常见的病因是结核性胸腔积液和恶性胸腔积液。恶性胸腔积液由恶性肿瘤胸膜转移或恶性胸膜间皮瘤引起，前者占恶性胸腔积液病因90％以上，肺部恶性肿瘤转移多见。结核性胸膜炎是由于胸膜下结核杆菌感染诱发严重的迟发型超敏反应而引起。炎症过程使胸膜血管通透性增高，富含蛋白质和特异白细胞的液体聚积在胸膜腔。CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞是特征性表达白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)受体α链(CD25)并具有抑制功能的CD4~+T淋巴细胞亚群，属于“职业抑制性T细胞”。CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞的反应性低下，并对CD4~+CD25~-T淋巴细胞增殖具有抑制作用。CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞必须通过其T细胞受体(T cell receptor，TCR)激活才能发挥抑制活性，一旦激活后其抑制活性是非特异的，可能通过细胞间直接接触、分泌细胞因子等方式抑制CD4~+和CD8~+等T淋巴细胞的活化和增殖。大量研究表明CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞对机体抗肿瘤免疫反应具有拮抗作用。最近的研究还证实CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞与人类肺结核有关。基于上述理论基础，本研究将探讨结核性及恶性胸腔积液中CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞的数量及其功能，并研究CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞浸润到胸膜腔的可能机制，为结核性及恶性胸腔积液的免疫学治疗提供新的切入点。 第一部分CD~4+CD25~+调节性T淋巴细胞在恶性胸腔积液中的意义 目的：检测肺癌合并胸腔积液患者外周血及胸腔积液中的CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞数量并研究胸腔积液中的CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞功能是否正常。 方法：同步采集15例肺癌合并胸腔积液患者的胸腔积液和外周血，13例可切除的原发性肺癌不合并胸腔积液的患者术前采血，开胸手术时进行胸腔灌洗并收集灌洗液，另采集14例健康对照者外周血。用流式细胞术检测上述标本中CD4~+CD25~+T淋巴细胞的百分比及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)的表达情况。用RT-PCR检测Foxp3转录因子。分离胸腔积液和外周血中的CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~-T淋巴细胞，体外培养并观察CD4~+CD25~+T对CD4~+CD25~-T淋巴细胞增殖反应的影响。 结果：肺癌合并恶性胸腔积液患者胸腔积液中CD4~+CD25~+T淋巴细胞数量占CD4~+T淋巴细胞的比例(18．9±1．7％)高于肺癌无胸腔积液患者的胸腔灌洗液(10．7±0．6％)(P0．001)，这些细胞表达高水平CTLA-4和Foxp3。此外，CD4~+CD25~+T淋巴细胞强烈抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞的增殖反应，并且抗CTLA-4单克隆抗体能降低CD4~+CD25~+T淋巴细胞的抑制活性。 结论：恶性胸腔积液CD4~+CD25~+T淋巴细胞数量增多并且高表达Foxp3转录因子，是调节性T细胞，能强烈抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞的增殖反应，CTLA-4与恶性胸腔积液中CD4~+CD25~+T淋巴细胞发挥抑制活性有关。 第二部分CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞在结核性胸腔积液中的意义 目的：检测结核性胸腔积液患者外周血及胸腔积液中的CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞数量并了解胸腔积液中的CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞功能是否正常。 方法：同步采集16例新近诊断为结核性胸腔积液患者的胸腔积液和外周血，另采集15例健康对照者外周血。用流式细胞技术检测上述标本中CD4~+CD25~+T淋巴细胞的百分比。用RT-PCR检测Foxp3转录因子。分离胸腔积液和外周血中的CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~-T淋巴细胞，体外培养并观察CD4~+CD25~+T对CD4~+CD25~-T淋巴细胞增殖反应的影响。 结果：结核性胸膜炎患者胸腔积液中的CD4~+CD25~+T淋巴细胞(19．2±1．5％)比同源患者外周血(12．1±0．8％)及健康对照者外周血(7．7±0．6％)中都多(P0．001)，并且这些细胞都高表达Foxp3。CD4~+CD25~+T淋巴细胞能强烈抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞的增殖反应。 结论：结核性胸腔积液CD4~+CD25~+T淋巴细胞数量增多并表达高水平Foxp3转录因子，是调节性T细胞，能强烈抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞的增殖。 第三部分IL-16与结核性及恶性胸腔积液中的CD4~+T淋巴细胞 目的：探讨胸腔积液中的IL-16水平及其与各类有核细胞数的相关性，研究IL-16对CD4~+T淋巴细胞的趋化活性。 方法：纳入32例结核性胸膜炎患者和30例肺癌合并胸腔积液的患者，进行胸腔积液有核细胞计数和分类，并测定IL-16浓度。用3色荧光流式细胞计量术检测胸腔积液细胞沉淀中的T淋巴细胞亚群。同时检测IL-16对CD4~+T淋巴细胞的趋化活性。 结果：结核性胸腔积液中IL-16水平(2118．1±227．0 ng／L)明显高于恶性胸腔积液(1068．7±101．3 ng／L)(P0．001)。但是，由于2组IL-16水平有明显重叠，该指标不能用于结核性胸膜炎和恶性胸膜炎的鉴别诊断。胸腔积液中IL-16水平与CD4~+T淋巴细胞数呈正相关(r=0．701，P0．001)，2组患者胸腔积液在体外都具有对CD4~+T淋巴细胞的趋化活性，并且加入IL-16单克隆抗体能抑制这种趋化活性。患者胸腔内注射IL-16使CD4~+T淋巴细胞进入胸膜腔明显增多。 结论：胸腔积液中的IL-16水平较血清升高，结核性胸腔积液较恶性胸腔积液升高更为明显，胸腔积液中IL-16水平与CD4~+T淋巴细胞数量呈正相关，IL-16可以直接诱导CD4~+T淋巴细胞进入胸膜腔。 第四部分CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞浸润到胸膜腔的机制 目的：检测胸腔积液中趋化因子CCL22和CCL17浓度，及CD4~+CD25~+T淋巴细胞表面相关受体CCR4和CCR8的表达及CCL22在体外对CD4~+CD25~+T淋巴细胞趋化活性，以探讨CD4~+CD25~+T淋巴细胞浸润到胸膜腔的可能机制。 方法：用ELISA法测定结核性胸腔积液及肺癌合并恶性胸腔积液各33例及漏出液18例患者的胸腔积液和外周血中趋化因子CCL22及CCL17浓度，用免疫荧光法检测胸腔积液中表达CCL22的细胞，用流式细胞术检测7例结核性胸腔积液和6例肺癌合并恶性胸腔积液患者的胸腔积液和外周血以及6例健康对照者外周血中CD4~+CD25~+T淋巴细胞表面CCR4及CCR8受体表达情况，并在体外测定CCL22及CCL17对CD4~+CD25~+T淋巴细胞的趋化活性。 结果：胸腔积液中CCL22水平增高，结核性胸腔积液中CCL22水平升高较恶性胸腔积液更为明显。胸腔积液中的肿瘤细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞均有CCL22表达，CD4~+CD25~+T淋巴细胞细胞表面CCR4受体表达增高。胸腔积液在体外具有对CD4~+CD25~+T淋巴细胞的趋化活性，抗CCL22单克隆抗体可以抑制这种趋化活性。 结论：结核性和恶性胸腔积液中CCL22水平均较外周血升高，且CD4~+CD25~+T淋巴细胞表面CCR4受体表达上调，CCL22可以诱导CD4~+CD25~+T淋巴细胞进入胸膜腔。胸腔积液中CCL22主要来源于肿瘤细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞。

【关键词】：CD4~+CD25~+T调节性T淋巴细胞 肺癌 肺结核 胸腔积液 IL-16 CCL22
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R561;R392
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