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《广西医科大学》 2008年
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弓形虫表面抗原SAG4基因的克隆、表达及鉴定

万孝玲  
【摘要】: 目的:获取弓形虫表面抗原SAG4目的基因序列,预测其编码蛋白作为候选疫苗的可行性。构建重组表达质粒pET28a(+)-SAG4,在大肠埃希菌表达系统中表达SAG4,并检测表达产物的免疫反应性,为弓形虫病的免疫诊断和疫苗研制奠定基础。 方法:提取RH株弓形虫的基因组DNA,根据GenBank中RH标准株弓形虫的SAG4基因序列设计引物,PCR法体外扩增获取目的基因片段。PCR产物经测序鉴定及胶回收纯化后,连接入pMD19-T载体中以构建重组克隆质粒pMD19-T-SAG4。用限制性内切酶NcoⅠ、XhoⅠ从pMD19-T-SAG4中切下目的基因,亚克隆入pET28a(+)载体中构建重组表达质粒pET28a(+)-SAG4,并采用双酶切反应及测序方法鉴定重组体。用生物信息学方法对重组SAG4基因编码序列进行同源性分析以及二级结构和抗原表位的预测。将重组表达质粒pET28a(+)-SAG4转入大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE及蛋白质印迹(Western blotting)技术分析鉴定表达产物的免疫反应性。 结果:PCR体外扩增获得的目的基因片段长537bp,经BLAST同源性分析显示该序列与RH株弓形虫SAG4基因cDNA具有高度同源性,而与其他生物的同源性较低。双酶切反应及测序分析显示,SAG4目的基因已被正确地连接入重组克隆质粒pMD19-T-SAG4和重组表达质粒pET28a(+)-SAG4中。BLAST比对及疏水性分析表明,重组基因编码产物为RH株弓形虫SAG4,是一种外膜蛋白;二级结构预测该产物可形成多个无规卷曲和β-转角区域;亲水性、可及性、柔韧性、极性参数及抗原表位的综合预测显示,其氨基酸序列的第40,80,120,130位点附近的抗原性指数较高。重组表达质粒pET28a(+)-SAG4经IPTG诱导后,在BL21中以包涵体的形式稳定表达SAG4。SDS-PAGE检测可发现一特异性蛋白区带,分子量约为18.74 ku,Western blotting分析显示该条带能被弓形虫慢性感染血清识别。 结论:首次从RH株弓形虫中克隆出缓殖子期特异性抗原SAG4基因编码序列;成功构建了SAG4目的基因的重组克隆质粒pMD19-T-SAG4与重组表达质粒pET28a(+)-SAG4;生物信息学分析技术预测出重组SAG4基因编码产物具有良好的抗原性;重组表达质粒pET28a(+)-SAG4在大肠埃希菌BL21中以包涵体形式高效表达了SAG4目的基因片段,该产物具有特异的免疫反应性。以此推测出SAG4不但是具有良好应用前景的弓形虫候选疫苗分子,还有望应用于弓形虫慢性感染的检测。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R392

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