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《广西医科大学》 2009年
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重组人血管抑素对碱烧伤角膜新生血管作用的实验研究

曾静  
【摘要】: 背景与目的 眼碱烧伤是严重的致盲性眼病,碱烧伤后角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成是导致视力下降的主要原因。其病理过程复杂,涉及诸多因素,确切的发病机理尚未完全阐明。CNV的治疗方法较多,但目前的治疗效果仍不太理想,因此研究CNV发病机制和探讨有效的治疗措施,将对防治CNV、防盲、治盲都具有极其重要的现实意义。 重组人血管抑素(angiostatin,AS)是近年来发现的血纤溶酶原的裂解片段,其前3个Kringle片段(Kringle 1-3,K1-3)对新生血管有较强的抑制作用,但作用机理尚未完全阐明,亦尚未见其对碱烧伤CNV中炎症细胞浸润、成纤维细胞及IL-1α表达影响的报道。本课题从建立角膜碱烧伤CNV模型着手,探讨AS对碱烧伤CNV的作用,利用免疫组化、ELISA和大鼠白细胞耗竭模型,探讨炎症细胞浸润、白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)以及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等在AS对碱烧伤CNV抑制作用中的作用机制。 材料与方法 1、30只SD大鼠制作左眼碱烧伤CNV模型,碱烧伤后观察角膜及新生血管动态生长情况,于碱烧伤后6h、1、3、7、14、21天随机取5只大鼠处死,取角膜行组织病理学检查了解碱烧伤后角膜组织学变化及炎症细胞浸润情况,探索合适的CNV模型。 2、重组人血管抑素K1-3:灭菌生理盐水无菌操作配制成10μg/ml、20μg/ml滴眼液,4℃冰箱保存备用。 3、105只SD大鼠随机取5只作正常对照(不作任何处理,取角膜作正常对照),其余100只制作左眼碱烧伤CNV模型,随机分为4组(每组25只):实验对照组、地塞米松组、K1组、K2组,分别点生理盐水、0.1%地塞米松眼液和10μg/ml、20μg/ml的K1-3滴眼液;于碱烧伤后1、3、7、14、21天每组随机取5只大鼠,测量CNV长度,计算CNV面积,分析K1-3眼液对CNV的作用。随后处死大鼠,取角膜备组织病理学检查、电镜检查、免疫组化和ELISA检测。 3、角膜切片HE染色,观察角膜组织学变化,各组碱烧伤后不同时间炎症细胞计数,比较各组角膜组织变化及炎症细胞浸润情况。 4、电镜观察碱烧伤后K1-3治疗组与对照组角膜超微结构改变。 5、制作大鼠白细胞耗竭模型,角膜碱烧伤,观察白细胞耗竭后角膜炎症细胞浸润及CNV生长情况,分析白细胞在碱烧伤角膜炎症反应及CNV形成中的作用及K1-3对碱烧伤角膜CNV及炎症细胞浸润的作用。 6、免疫组化检测4组碱烧伤后不同时间角膜VEGF表达,病理图像分析仪测量平均光密度值(optical density,OD)。CD34标记新生血管,检测各组角膜新生血管密度(microvessel density,MVD)。分析K1-3对碱烧伤角膜VEGF表达及MVD的影响。 7、ELISA检测各组角膜IL-1α表达,分析K1-3对碱烧伤角膜IL-1α表达的影响。 结果 1、成功建立碱烧伤CNV模型,大鼠角膜碱烧伤40s,为较理想的时间。 2、碱烧伤后3天对照组出现CNV,碱烧伤后7天生长旺盛,14天达高峰,布满角膜,21天略消退,但仍占据大部分角膜;K1-3治疗组碱烧伤后3天未见明显CNV,7天仅达碱烧伤斑边缘,14天仅少量CNV长至瞳孔区,21天消退明显。各时间点K1-3治疗组CNV面积及MVD均较对照组减少(P0.05),表明AS对碱烧伤CNV有明显的抑制作用。 3、碱烧伤后1-3天,对照组角膜切片中可见大量炎症细胞浸润(主要是中性粒细胞),7-14天时炎症细胞仍较多,21天时炎症细胞减少;碱烧伤后1、3、7、14天,K1组、K2组、地塞米松组角膜中炎症细胞浸润较对照组少(P0.05),K2组较K1组和地塞米松组少(P0.05)。21天时地塞米松组炎症细胞较K1-3治疗组增多(P0.05)。提示局部浸润的炎症细胞在角膜碱烧伤CNV形成过程中起重要作用;AS可通过抑制炎症细胞浸润而抑制CNV,其效果优于地塞米松。 4、角膜组织切片显示,碱烧伤后21天,对照组角膜中央混浊,K1-3治疗组角膜较透明。电镜超微结构显示,碱烧伤后对照组角膜上皮基底膜连接松散,前弹力膜和基质层间半桥粒数量减少,细胞间隙变宽。基质胶原纤维排列紊乱,成纤维细胞增大,细胞内线粒体、粗面内质网增多;K1-3治疗组角膜损伤较对照组轻,细胞间连接较对照组紧密,基质层胶原纤维排列相对整齐,成纤维细胞形态及结构变化不明显。显示AS可抑制角膜成纤维细胞过度增生,抑制角膜瘢痕形成。 5、大鼠灌服环磷酰胺3天后外周血白细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞数均明显下降(P0.05);白细胞耗竭鼠角膜碱烧伤,发现角膜中浸润的炎症细胞及CNV面积较对照组减少(P0.05)。 6、正常角膜中VEGF无表达或仅在上皮层有微弱表达,碱烧伤后4组角膜VEGF表达上升,1周左右达高峰,主要表达于新生血管内皮细胞及浸润的炎症细胞内,碱烧伤后各时间点K1-3治疗组VEGF表达及OD值均明显低于对照组(P0.05)。提示AS可降低碱烧伤角膜VEGF表达,从而抑制CNV。 7、IL-1α在正常角膜中有少量表达,碱烧伤后4组IL-1α表达均明显升高,3天时达高峰,7天后开始回落,21天回落至正常水平。碱烧伤后各时间点K1-3治疗组IL-1α表达均明显低于对照组(P0.05),表明AS可降低IL-1α表达,从而抑制CNV。 结论 1、角膜碱烧伤40s是一种简单方便的CNV模型,可成功诱导CNV,且无严重并发症。 2、重组人血管抑素K1-3可抑制碱烧伤CNV形成、减轻炎症反应、促进角膜愈合,作用呈剂量依赖性。 3、重组人血管抑素K1-3抑制碱烧伤CNV形成的作用机制可能是通过抑制角膜IL-1α、VEGF的表达及抑制炎症细胞浸润实现的。 4、重组人血管抑素K1-3可抑制成纤维细胞的过度激活,抑制瘢痕形成,减轻角膜混浊。 5、电镜超微结构显示K1-3治疗CNV未见角膜细胞损伤,对角膜无毒副作用,提示K1-3可能成为临床治疗CNV的一个新途径。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R96

【引证文献】
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