早期激素性股骨头坏死差异蛋白质组学分析及相关蛋白表达验证

【摘要】： 随着激素在临床上广泛应用,激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)已居非创伤性股骨头坏死的首位。目前SANFH的发病机制尚不明确,众多发病学说往往仅从单一的分子或基因水平上对SANFH发病机理进行研究,无法整体、动态、多层次地了解SANFH发生过程中相关调控基因和相关功能基因蛋白产物的种类、数量及峰值变化规律。随着后基因组时代的来临,蛋白质组学研究的兴起,为我们研究SANFH的发病机制提供了新的思路及技术手段。 目的:(1)通过反复大剂量注射地塞米松联合增加股骨头负重的方法建立兔早期SANFH模型,为后续比较蛋白质组学研究提供较为理想的动物模型。(2)优化兔股骨头蛋白质组双向电泳(2-DE)技术。(3)创建早期SANFH不同时点(注射激素后3w、6w、9w、12w )与正常股骨头的蛋白质表达图谱,经图像分析及质谱鉴定后筛选出差异蛋白并观察其变化规律。(4)对差异表达蛋白Annexin A1进行表达验证,以证实2-DE结果的可靠性。 方法:(1)健康成年新西兰大白兔48只,随机分为模型组和对照组。模型组臀肌注射地塞米松针(10mg/kg),每次间隔48h,通过迫使兔子站立进食水增加股骨头负重,对照组相同时点注射等量生理盐水。分别于给药后3w,6w,9w,12w处死兔子,每次模型组和对照组各6只。观察动物一般状态、股骨头外观、病理学改变(包括骨髓腔内脂肪细胞、骨小梁及骨细胞)及骨细胞Caspase-3活性变化情况。(2)用健康成年新西兰大白兔股骨头作为样本,改进2-DE程序中的几个关键环节,对样品制备(骨组织破碎、细胞裂解、除盐)、等电聚焦程序、固相胶条的选择和凝胶染色方法进行一系列比较和优化。(3)获取SANFH早期病理变化过程的不同时间点(注射激素后3w、6w、9w、12w)及正常股骨头坏死标本,利用2-DE技术创建早期SANFH不同时点与正常股骨头的蛋白表达图谱,运用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异点进行鉴定。(4)应用免疫印迹(Western Blot)技术检测Annexin A1在各组的表达水平,并与2-DE结果进行比较。 结果:(1)模型组给药3w后可见骨髓腔内脂肪细胞体积增大,数量增多,并且随给药时间的延长脂肪细胞肥大更为明显,甚至发生融合,骨髓干细胞相对减少,脂肪细胞面积百分比大于对照组(P0.05);模型组6w后空骨陷凹率大于对照组(P 0.05);模型组9w后可见骨小梁稀疏变细、结构紊乱、断裂,骨小梁面积百分比小于对照组(P0.05);电镜下骨细胞形态发生异常改变;模型组给药6w后骨细胞Caspase-3活性高于对照组(P 0.05)。(2)采用组织匀浆法破碎骨组织,改良细胞裂解液进行蛋白质提取,丙酮沉淀法除盐,选择24cmPH3-10NL的固相胶条上样,调整后的等电聚焦(IEF)程序进行电泳,胶体考马斯亮兰染色法进行凝胶染色可以得到较为理想的蛋白表达图谱。(3)获得分辨率和重复性较好的早期SANFH不同时间点及正常股骨头的蛋白表达图谱。通过比较后发现24个差异蛋白点(差异大于2倍),经质谱成功鉴定出20个,其中7种蛋白质在早期SANFH中呈现表达上升,另外13种蛋白呈现表达下降。(4)Western blot显示早期SANFH中Annexin A1的表达水平低于对照组,其表达趋势与2-DE结果相一致。 结论:(1)反复大剂量注射地塞米松联合增加股骨头负重的方法可以诱导出兔早期SANFH模型。(2)建立并优化了兔股骨头蛋白质2-DE技术,得到了比较理想的2-DE图谱,为进一步开展疾病差异蛋白质组学研究提供了良好的技术条件。(3)经过优化后的2-DE技术,获得了早期SANFH不同时点及正常股骨头蛋白质表达图谱。发现了20种差异表达的蛋白,丰富了疾病相关的差异蛋白质组学的数据,初步筛选出潜在的与疾病早期发病机制相关的重要蛋白质。(4)Western blot结果与2-DE结果相一致,验证了之前实验获得Annexin A1表达变化趋势的正确性,Annexin A1可以成为进一步研究疾病早期发病机制的候选蛋白分子。

【关键词】：兔 激素性股骨头缺血性坏死 差异蛋白质组学 双向电泳 膜联蛋白A1
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R681.8
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