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《广西医科大学》 2010年
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肝癌相关抗原SMP30 mRNA在癌细胞中的表达及其单克隆抗体的制备

李晓龙  
【摘要】: 目的:检测衰老标记蛋白(SMP30)mRNA在不同癌细胞系中表达水平,探讨其在不同细胞中的表达差异性;建立稳定分泌SMP30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 方法:常规培养正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,设计SMP30及内参P53基因上下游引物,分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞和四种癌细胞系中的表达情况。基因工程表达、分离,纯化SMP30蛋白后,用此蛋白免疫4-6周BALB/c雌性小鼠,应用间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价,取血清效价大于1:16000的小鼠脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,并进行HAT、HT选择培养后,观察融合细胞克隆的生长,应用间接ELISA法测定融合细胞培养上清液中抗SMP30抗体的存在,将抗体阳性融合细胞进行克隆化培养。 结果:紫外分光分析仪检测各种癌细胞总RNA的A260/A280比值,结果均为1.895±0.082,表明提取的总RNA质量较好。半定量RT-PCR测得SMP30mRNA在肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的相对表达量分别是0.612±0.324、0.579±0.304、0.486±0.223和0.469±0.215,各癌细胞之间SMP30 mRNA表达没有明显差异,而在正常肝细胞中SMP30 mRNA的表达量为0.102±0.065,相对前几种癌细胞表达量较低,差异有统计学意义(P0.05)。荧光定量PCR法测得SMP30 mRNA在所有细胞株中均有表达,在肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌细胞中的表达量分别为0.926±0.340、0.922±0.379、0.614±0.356和0.608±0.346。正常肝细胞的表达量为0.175±0.158,显示SMP30mRNA在癌细胞的表达量较正常肝细胞表达量高(P0.05)。基因工程表达、分离纯化得到纯的SMP30蛋白,免疫雌性小鼠后获得5只血清效价大于1:16000BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,成功得到5孔阳性较高的融合细胞克隆。 结论:SMP30mRNA在癌细胞中的表达量高于正常肝细胞。探索了SMP30单克隆抗体的研制方法,得到了5孔阳性较高的融合细胞克隆,为后续研究提供平台。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.7

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