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《广西师范大学》 2017年
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唐氏综合征母体胎源性CircRNA差异性表达谱及功能分析

常燕  
【摘要】:唐氏综合征(Down Syndrome,DS),也被称为21-三体综合征,由第21号染色体多了一份拷贝而引起,它是常染色体数目异常引起的最常见的出生缺陷疾病。DS患者一般均具有较为常见的临床表现,包括轻度至中度学习障碍、颅面异常、体格发育迟缓等,并常伴有免疫力低下、先天性心脏病、白血病以及早期出现的阿尔兹海默病等。DS给家庭和社会带来了沉重的经济负担。目前,避免DS患儿出生的唯一医疗手段是对孕妇进行全面的产前筛查和产前诊断。然而,传统的产前筛查具有检出率低、漏检率和假阳性率相对较高的缺点,胎儿染色体产前诊断相关方法则因为侵入式取样的手段容易产生出血、流产或患有其它并发症。而已有的无创性的产前诊断方法又存在步骤繁琐、成本较高等问题。因此,基于传统产前筛查和产前诊断的缺陷,以及已有无创性产前诊断方法不足的现状,探索新的无创性唐氏综合征胎儿产前诊断标志物具有非常重要的意义。目的:本研究拟从circRNA为切入点,利用基因芯片技术从妊娠有唐氏综合征胎儿孕妇和正常胎儿孕妇的脐带血中筛选出差异性表达的circRNA,并采用RT-PCR技术对筛选出的胎源性差异表达的circRNA在外周血中进行验证,以寻找潜在的标志物;同时利用相同的方法筛选差异表达mRNA,对circRNA与mRNA进行关联分析,并通过基因信息生物学对差异基因进行功能分析,为建立新的无创性DS胎儿产前筛查诊断新方法提供依据。方法:选取12例孕妇脐带血标本(其中包括6例经G显带染色体核型分析确诊为标准型唐氏综合征胎儿的脐带血标本以及6例健康胎儿脐带血),利用Trizol法提取总RNA,使用NanoDropND-1000检测RNA是否降解并测定RNA浓度;采用Agilent表达谱芯片分析样本中的circRNA、mRNA差异表达谱;应用RT-PCR验证差异表达的circRNA和mRNA在唐氏综合征患儿以及健康儿童外周血中的表达情况;并使用Arraystar的自制miRNA靶基因预测软件对circRNA上的miRNA结合位点进行预测;最后采用上述Agilent公司检测的circRNA和mRNA表达谱芯片数据,对筛选出的DS母体胎源性差异表达circRNA表达谱和mRNA基因表达谱信息进行整合分析,寻找circRNA与mRNA的关联作用,以探究I circRNA在DS中的功能及其发生机制。结果:(1)两组脐带血样本中共检测到差异表达circRNA4568个,其中显著差异表达circRNA 735个,包括差异性上调表达circRNA 414个,差异性下调表达circRNA 321个。外周血中 RT-PCR 验证结果表明 hsa circRNA_103135、hsa_circRNA_103137、hsa_circRNA_101116表达差异不具有统计学意义(P0.05);而 hsa_circRNA_103127、hsa_circRNA_103112、hsa_circRNA_104907 表达差异具有统计学意义(P0.05);(2)共检测到17567个差异表达mRNA,其中显著表达差异的mRNA 6619个,包括差异性上调表达mRNA 3411个,差异性下调表达mRNA 3208个。外周血中RT-PCR验证结果表明DYRK1A、STRBP表达差异不具有统计学意义(P0.05);而USP25表达差异具有有统计学意义(P0.05);(3)通过对差异表达基因进行GO分析,发现参与生物过程的基因有805个,其中315个基因表达上调,490个基因表达下调,富集最大的5种生物过程为:细胞过程、主要代谢过程、细胞代谢过程、生物调节和氮化合物代谢过程;参与细胞组成的基因有189个,其中66个基因表达上调,123个基因表达下调,富集最大的5种细胞组成为:细胞内、细胞内的部分、细胞器、细胞内的细胞器和膜结合细胞器;参与分子功能的基因有155个,其中77个基因表达上调,78个基因表达下调,富集最大的5种分子功能为:结合、蛋白结合、RNA结合、连接酶活性和催化活性。对差异基因进行pathway通路分析,发现差异基因显著富集通路73条,23个基因上调表达,50个基因下调表达。差异表达基因主要涉及粘合斑,ECM受体相互作用,间隙连接,蛋白消化和吸收,维生素消化和吸收,TNF信号通路等,也参与了原发性免疫缺陷,类风湿性关节炎,致心律失常性右心室心肌病(ARVC),系统性红斑狼疮,Ⅰ型糖尿病以及同源重组等其它过程;(4)对具有2倍差异的circRNA与对应的差异基因表达谱信息关联,我们发现有254个差异表达circRNA可能通过吸附特定的miRNA,调控其靶基因mRNA的表达。结论:(1)在本实验的唐氏综合征样本中,胎儿circRNA发生了差异性表达变化;(2)差异表达circRNA有其对应的miRNA结合位点,可能作为miRNA海绵通过与miRNA的结合进而调控靶基因的表达;(3)差异表达的基因主要参与了细胞分裂与发育过程,也参与了原发性免疫缺陷,类风湿关节炎,Ⅰ型糖尿病等的发生以及同源重组过程,可能是21号染色体拷贝异常导致的基因表达紊乱,可能与DS胎儿免疫系统的发育缺陷、免疫力低下、智力发育异常、体格发育迟缓等各种临床症状密切相关;(4)Hsa_circRNA_103112不仅在DS胎儿脐带血中显著性差异表达,在外周血中也存在显著性差异表达,其相应的靶基因USP25与DS患者各种临床症状的产生有关,该结果提示过表达的Hsa_circRNA_103112可能通过circRNA-miRNA-mRNA之间的相互作用引起二倍体基因的表达失衡,参与唐氏综合征的病理发生。孕妇外周血中的Hsa_circRNA_103112可能是胎儿DS无创产前筛查诊断的潜在的重要标志物之一。
【学位授予单位】:广西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R714.5

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