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《广西师范大学》 2018年
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罗汉果内生菌中产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选及酶法改性罗汉果苦味苷的研究

张昌志  
【摘要】:罗汉果在实际的种植中,每年季末因为天气和植物营养消耗的原因,导致很多罗汉果无法成熟,这些未成熟果主要含有苦味的罗汉果苷Ⅱ,这些苷Ⅱ还未转化成高糖苷,形成所谓的苦果。在生产上,这些苦果一般都是被遗弃,造成极大浪费。但罗汉果苦苷和甜苷都是以罗汉果醇为骨架,有着相同的基本骨架,只是C-3和C-24连接的葡萄糖基数量有所差异。在罗汉果甜苷合成的过程中,葡萄糖基转移酶发挥着重要作用,它将葡萄糖基逐个添加到苦味苷上,使苦味的低糖苷转化为甜味的高糖苷。而罗汉果内生菌长期与罗汉果互利共生,可能会与罗汉果发生基因交流,有可能从罗汉果内生菌中筛选出产生糖基转移酶的菌株。因此,研究从罗汉果内生菌中筛选出产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的菌株,并对菌株进行鉴定,再优化该菌株的产酶条件,建立以硫酸铵盐析、透析和葡聚糖凝胶柱层析为主的分离纯化体系,从而得到CGTase,并测定该酶的酶学性质,最后初步探讨CGTase对罗汉果苦味苷的转化作用。主要完成的内容如下:1.罗汉果内生菌的分离选用75%乙醇和3%次氯酸钠对罗汉果根、茎和果实消毒,不断增加或减少消毒时间,根据消毒效果,对不同部位选择不同消毒时间。再将消毒后的罗汉果各部位切块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基三种培养基中,从而分离罗汉果根、茎、果实各部位的内生菌,最终从根中分离得到20株真菌,9株细菌,2株放线菌;茎中分离得到23株真菌,10株细菌,4株放线菌;果中分离出15株真菌,10株细菌。2.产CGTase菌株的筛选及菌株ND-6的鉴定利用酚酞-甲基橙平板法和碘-淀粉平板法从罗汉果内生菌中筛选获得11株CGTase产生菌,再测定酶活复筛得到CGTase酶活最高的菌株,编号为ND-6。对菌株ND-6进行形态鉴定,发现菌落呈圆形、中间皱起,边缘平整,略带黄色;菌株在光学显微镜下呈杆状,革兰氏染色为阳性,有芽孢、芽孢位于菌体中间。为了进一步确定菌株ND-6的种属,用细菌的16S rDNA通用引物从ND-6的基因组DNA中PCR扩增得到1条1445 bp的条带,将PCR扩增产物测序,获得的序列NCBI检索,结果显示ND-6与Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus sp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA序列同源性为99%,因此,菌株ND-6在分子系统发育分类学上属于芽孢杆菌;综合形态特征观察和分子生物学测序结果,最终确定ND-6菌株为芽孢杆菌,命名为Bacillus sp.ND-6,简称ND-6。3.产CGTase菌株发酵条件的研究采用单因素试验研究碳源、氮源、发酵温度、pH值、装液量等因素对产酶的影响,并根据单因素实验结果设计正交实验进一步优化产酶条件。结果表明,菌株产酶酶活的高低受碳源、氮源、发酵温度、pH值、装液量等因素的影响,且初始pH值对菌株产酶有显著影响。菌株最佳产酶培养基为:蛋白胨10 g,环糊精10 g,酵母提取物5 g,K_2HPO_4 0.2 g,MgSO_4·7H_2O 0.2 g,Na_2CO_3 0.2 g,水定容至1 L,初始pH值为8;发酵条件为:接种量为4%,装液量为70 mL(250 mL锥形瓶中),发酵温度为40℃,160 r/min培养72 h。验证试验时,菌株所产CGTase酶活最高可达9 753U/mL,较优化前提高了1.43倍。4.CGTase的分离纯化及酶学性质的研究按优化后的发酵条件对菌株ND-6制备级发酵,发酵液离心得粗酶液,再经硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析,粗酶液被纯化5.48倍,得率为34.3%。PAGE凝胶电泳显示为一条带,测定其分子量为90 kDa。考察了不同pH值、温度、金属离子对酶活的影响。结果表明,该酶反应的最适温度为60℃,在30~50℃基本稳定,最适pH值为6.0,在pH 5.0~7.0范围内基本稳定。Ca~(2+)对该酶有促进作用,而Mn~(2+)、Fe~(2+)、Li~+、Cu~(2+)对该酶活力有较明显的抑制作用。5.CGTase对罗汉果苦味苷转化作用的初步探讨将罗汉果青果破碎,加8倍水,在超声波清洗机(80 kHz,350 W)中60℃下浸提15 min,得到罗汉果粗提物,在经大孔吸附树脂AB-8、离子交换树脂DM330和硅胶柱层析三级分离纯化得到初步纯化的罗汉果苦味苷。当罗汉果苦味苷为1 mg,淀粉量是罗汉果苦味苷3倍,加酶量为1 mL时,利用纯化得到CGTase 50℃震荡反应12 h,经TLC检测,有大极性斑点出现,HPLC鉴定发现与对照相比峰面积变化显著,10人感官评定小组品尝后也一致认为罗汉果苦味苷的苦味得到改善。
【学位授予单位】:广西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q93;S668.9

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