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PRMT5对TRAF2及Nur77的甲基化及相关机制研究

姚艳玲  
【摘要】:PRMT5是一种II型精氨酸甲基转移酶,可以诱导对称的精氨酸甲基化,甲基化组蛋白和非组蛋白底物的精氨酸残基。研究表明PRMT5在基因转录调控中起着重要作用。已知PRMT5为一种甲基转移酶,且具有众多的底物。因此研究PRMT5的甲基化功能是很有必要的。我们从以下角度探索了PRMT5对肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF2和核孤儿受体Nur77的甲基化作用,并进一步对机制进行了探究。第一,我们运用免疫共沉淀、GST-Pulldown及免疫荧光等技术探讨PRMT5与TRAF2的相互作用,并且我们构建了TRAF2不同片段质粒,把相互作用锁定在TRAF2的TRAF结构域。为了进一步研究PRMT5对TRAF2的甲基化作用,我们在293T细胞中分别转染有活性和没有活性的PRMT5,发现有活性的PRMT5可以甲基化TRAF2。同时,我们检测到PRMT5可以调控TRAF2的蛋白表达并在一定程度上促进TRAF2的泛素化。众所周知,TRAF2是NF-κB信号通路中关键衔接蛋白,所以,我们用Western blot检测了PRMT5对NF-κB信号通路中相关蛋白的影响。有意思的是我们发现当在细胞中过表达TRAF2时,NF-κB激酶NIK的表达升高;而共转入PRMT5质粒后,NIK的这种升高趋势会被抑制。这提示我们PRMT5可能会影响非经典的NF-κB信号通路。接着,我们用同样的方法处理细胞,检测了P100/P52的变化,证实TRAF2会促进P52的积累而过表达PRMT5后这种积累会受到抑制。目前关于NIK的变化主要有两种说法:TRAF3与NIK直接相互作用来泛素化降解NIK;TRAF2/TRAF3作为桥梁促使cIAPs泛素化NIK。无论哪一种说法都离不开TRAF3的作用,因此我们检测了TRAF3及NIK的泛素化。接下来,我们进一步探究PRMT5对cIAP1与TRAF2的相互作用及cIAPs对TRAF2的泛素化的影响,为进一步阐释PRMT5对TRAF2介导的NF-κB信号通路作用提供理论依据。第二,我们研究了PRMT5对Nur77的甲基化作用。首先,我们检测到PRMT5与Nur77存在直接相互作用,并且Nur77是PRMT5的甲基化底物。其次,我们发现我们课题组之前研究的黄酮类药物二氢杨梅素(DHM)可以抑制PRMT5与Nur77的相互作用,并且DHM可以抑制Nur77的磷酸化,而该磷酸化是被AKT介导的。DHM进一步促进AMPK的磷酸化呈剂量依赖性和时间依赖性,可能是因为DHM抑制了Nur77与LKB1的结合。为了进一步明确Nur77和DHM的关系,我们分别用分子模拟对接、圆二色谱法和等温滴定量热法证实了Nur77的配体结合结构域(LBD)和DHM的物理结合,表明LBD确实与DHM存在相互作用。我们进一步在C57小鼠上构建Ⅱ型糖尿病模型,血糖稳定后灌胃DHM,发现DHM可以治疗Ⅱ型糖尿病并且治疗效果和阳性药二甲双胍相当,结果表明DHM可以显著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受。为了进一步确定DHM治疗糖尿病的作用是否与Nur77相关,我们在Nur77基因敲除鼠上也构建了Ⅱ型糖尿病模型,灌胃DHM后发现DHM对Nur77基因敲除糖尿病鼠的治疗效果不显著。与此同时,我们检测了实验小鼠的血浆胰岛素水平及肝脏中糖异生相关基因的表达,均提示DHM治疗糖尿病或许与Nur77相关。总之,本论文主要探讨了PRMT5甲基化TRAF2来调控非经典NF-κB信号通路;阐明了DHM可能参与调控PRMT5与Nur77复合物,并且DHM治疗Ⅱ型糖尿病可能依赖于核孤儿受体Nur77,为治疗糖尿病药物研发提供理论依据。


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