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《广西师范大学》 2008年
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高效液相色谱—共振瑞利散射检测技术及其应用研究

罗志辉  
【摘要】: 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)以分离效率高,分析速度快,灵敏度高和应用广泛的特点,已成为分析科学的一个重要分支;新型高效通用的检测技术的研发和联用一直是高效液相色谱法(HPLC)的主要发展方向之一。共振瑞利散射检测技术以其灵敏度高、方法简便而引起广泛关注,但这种方法对复杂样品的测定略显不足,如能将液相色谱的分离功能与共振散射检测相结合,将是一个极具潜在应用前景的分析技术。 目前,蛋白质和氨基糖苷类抗生素的分析方法很多,但大多数需要衍生,或用短紫外波段来检测,准确度和灵敏度都较低,因此,对它们的分离与测定,在生物医学研究和质检等相关领域均具有重要意义。 本文建立了高效液相色谱-共振瑞利散射联用检测技术,并对样品进行了测定。主要研究内容有以下四方面: 1、研究并建立了高效液相色谱-共振瑞利散射联用新技术。用阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)为光谱探针,商品荧光检测器检测,以牛胰岛素(Insulin,Ins)、细胞色素C(Cytochrome,Cyt-c)、溶菌酶(Lysozyme,Lys)和人血清白蛋白(Human serum albumin HSA)为分离分析目标物,考察高效液相色谱-共振瑞利散射联用技术的可行性,并进行方法学研究,通过柱后离子缔合模型的建立,确定了该技术的整体方案。结果表明,此新方法有较高的灵敏度,操作简便,重复性好,显示出在高效液相色谱检测方法中具有较广阔的应用前景,为实际样品的测定建立了可靠的分析方法。 2、基于建立的高效液相色谱-共振瑞利散射联用技术,以比布列西猩红为光谱探针,分离测定四种蛋白质。三氟乙酸-乙腈混合液为流动相,采用梯度淋洗技术,用Sinochrom ODS-AP色谱柱(150 mm×4.6 mm, 300à, 5μm)分离,Cyt-c、Lys、HSA、免疫球蛋白(γ-globulin,γ-Glo)四种蛋白质在12 min内完全分离,通过其与比布列西猩红相互结合,形成较各自体积更大的离子缔合物,用共振瑞利散射技术进行检测,检测波长为λEx=λEm=376 nm。Cyt-c,Lys,HSA,γ-Glo浓度分别在0.20~3.0μg·mL-1,0.25~2.5μg·mL-1,1.5~10μg·mL-1,2.0~15μg·mL-1时,与峰面积呈良好线性关系,线性相关系数都在0.99以上。当信噪比为3(S/N=3)时,四种蛋白质的检测限在0.2~1.0μg·mL-1范围内。并应用于对人血清中白蛋白和球蛋白的含量测定。 3、以滂胺天蓝作为光谱探针,采用高效液相色谱-共振瑞利散射联用技术,建立了测定妥布霉素的新方法。此方法用diamond ODS色谱柱分离,等度洗脱,在优化了分离条件后,研究了缓冲溶液的pH,反应管长,探针流速和探针的浓度等对灵敏度的影响。在选定的最佳分离条件和最优的结合条件下,妥布霉素在10 min内得到良好的峰形,将方法应用于妥布霉素滴眼液中妥布霉素含量的测定。结果表明:采用本法测定结果与商品标示值一致。本方法快速、简单、重现性好、精密度高、能检测无紫外荧光基团的物质,而且没有干扰,为生产、质检等部门提供了一种可靠的方法。 4、建立了分离检测庆大霉素组分的新方法。以滂胺天蓝为光谱探针,采用高效液相色谱-共振瑞利散射联用技术,对庆大霉素组分进行详细研究。用C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm)分离,流动相为0.24%三氟乙酸水溶液-甲醇(96.5:3.5),流速为0.5 ml?min-1,等度洗脱。柱后探针溶液流速为0.08 ml?min-1,在λEx=λEm=356 nm检测。结果表明:庆大霉素中的4个主要组分C1、C1a、C2、C2a,在上述色谱条件下分离良好,分析时间仅为15 min。浓度分别在7.2~115.2、8.2~131.6、7.5~78.8、8.5~78.0μg·mL-1范围内具有良好线性关系,相关系数分别为0.9928、0.9973、0.9980、0.9981。方法检出限(S/N≥3)分别为7.2、6.0、6.0、6.8μg·mL-1。峰面积测定值的相对标准偏差(RSD%)分别为1.6%、2.2%、3.0%、3.0%。庆大霉素注射液采用本法测定结果与2005版的中国药典规定的范围一致。本法操作简单、快速、精密度、重现性能够很好的满足质量控制的要求。
【学位授予单位】:广西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:O657.72

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