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《四川大学》 2020年 硕士论文
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猪脂肪源基质水凝胶促进游离移植脂肪存活的实验研究

刘鹏程  
【摘要】:研究背景:外伤、手术、先天发育异常等均可导致软组织缺损或缺失。游离脂肪移植因填充物(脂肪)来源广泛,兼具填充与形态塑造的效果,是软组织缺损填充修复最常用的技术之一~([1-3])。然而,游离脂肪移植过程中成熟脂肪细胞的物理损伤或组织/血管再生不足可导致部分脂肪细胞无法存活~([4,5]),相关文献报道游离脂肪移植体积保留率在10%-85%之间~([6-9])。移植物体积保留率是决定游离脂肪填充术手术效果最重要的因素之一,促进游离移植脂肪存活进而提高体积保留率是目前游离脂肪移植亟需解决的问题~([10])。近年来,已有研究尝试使用生物材料提供和改善细胞存活和诱导原位脂肪再生的局部微环境~([11-14])。水凝胶类生物材料富含水,可促进更好的氧气和营养物质交换~([15])。以水凝胶作为细胞/组织载体,可通过减少组织损伤提高移植组织存活率。部分研究证实,与常规的组织/细胞移植相比,基于水凝胶生物材料(例如胶原蛋白和透明质酸)的组织/细胞移植具有更好的组织存活率~([15-18])。大量研究证实,来自不同组织的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)可以为组织再生提供不同的微环境。前期我们课题组及其他研究者发现,脱细胞的脂肪组织基质材料可以提供独特的成脂诱导微环境~([12,19-22])。前期研究中,我们制备了一种天然可注射的温敏性材料--猪脂肪源基质水凝胶(Hydrogel from acellular porcine adipose tissue,HAPA),并证实了其对脂肪来源干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)在体内、外的诱导成脂作用,以及其他宿主衍生的原位成脂诱导特性~([19,23])。因此本研究率先采用HAPA复合游离脂肪移植的办法,研究HAPA对游离移植脂肪存活的影响。然而,单纯生物源性水凝胶降解速度较快,在较短时间内即可引起较明显的体积保留率变化,因此在利用生物源性水凝胶辅助游离脂肪移植时应当考虑单纯水凝胶降解对移植物总体体积保留率所产生的影响。本研究中亦关注了不同HAPA/脂肪体积比对游离移植脂肪存活及总体体积保留率的影响。研究方法:第一部分:HAPA促进游离移植脂肪存活的体外研究:游离移植脂肪由大量的脂肪细胞和极少量的脂肪干细胞构成,低氧是自体脂肪移植后早期脂肪细胞和脂肪干细胞死亡的主要原因之一。在体外研究中,通过模拟脂肪移植后早期急性的缺氧环境,分别研究常氧、低氧条件下HAPA对ADCSs及脂肪颗粒生物学行为的影响。采用24孔Transwell小室建立共培养模型,上层小室均包被3%HAPA,下层孔板接种ADSCs,单纯ADSCs作为对照,采用CCK8法分别检测常氧(21%O_2)及低氧(2%O_2)条件下细胞增殖情况;采用Elisa法测定培养基中VEGF浓度。将ADSCs分别接种于孔板及HAPA表面,分别使用高糖DMEM完全培养基(阴性对照组)于常氧(21%O_2)及低氧(2%O_2)条件下培养14天后,油红O染色观察细胞内脂滴形成情况。体外条件下,将单纯游离脂肪和HAPA/脂肪复合物(体积比1:1)分别于常氧、低氧(2%O_2)下培养,通过Perilipin A免疫荧光、Tunel免疫荧光检测等方法初步观察在体外培养的常氧、低氧条件下HAPA对脂肪颗粒中细胞存活及凋亡情况的影响。通过Real-time PCR、免疫组化检测各组低氧相关基因HIF-1α(hypoxia inducible factor-1)基因及蛋白表达变化,初步探索HAPA促进游离移植脂肪存活的可能机制和理论基础。第二部分:HAPA及ADSCS促进游离移植脂肪存活的动物实验研究:建立裸鼠背部皮下脂肪移植模型,并设立对照组(脂肪+PBS)、ADSCs组(脂肪+ADSCs)、HAPA组(HAPA+脂肪)、HAPA+ADSCs组(HAPA+脂肪+ADSCs)及组织工程脂肪组(HAPA+ADSCs),通过体积测量、在体彩超评估及组织学染色等方法初步观察HAPA对游离移植脂肪存活的影响。第三部分:HAPA辅助脂肪移植的HAPA/脂肪体积比优化的体内研究按不同HAPA/脂肪体积比分为单纯脂肪组、10%HAPA组、20%HAPA组、30%HAPA组、40%HAPA组、50%HAPA组行裸鼠背部皮下移植。移植4周后取移植物行大体观察、体积测量、超声观察及组织学评价,探讨不同HAPA/脂肪体积比对游离移植脂肪存活及总体体积保留率的影响。结果:1.常氧条件下,HAPA可促进ADSCs的增殖(P0.05)。低氧条件下ADSCs增殖明显(P0.05),且这种促进作用在HAPA存在的条件下更显著(P0.05)。2.相较于常氧培养,低氧培养并不促进ADSCs分泌VEGF(P0.05)。然而,当复合HAPA培养,低氧条件下可分泌更高水平的VEGF(P0.05)。3.HAPA能诱导ADSCs成脂,且在低氧条件下能保持对ADSCs的定向诱导成脂能力。4.低氧环境促进细胞凋亡(P0.05)及移植脂肪坏死,复合HAPA后凋亡细胞有减少趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。5.体外低氧有诱导脂肪细胞HIF 1α表达水平上调的趋势,HAPA有降低移植脂肪组织HIF-1α表达水平下调的趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。6.体内实验显示,随着时间推移,各组移植物体积逐渐变小。HAPA(有或无ADCSs)复合的脂肪移植具有最高的体积保留率,而组织工程脂肪组(HAPA+ADSCs)组体积缩小最明显(P0.05)。7.HE染色显示,未完全降解的HAPA与脂肪组织融合良好。HAPA(有或无ADSCs)及ADSCs辅助的脂肪移植能提高移植脂肪完整性,减少囊肿/囊泡形成及减轻纤维化程度(P0.05)。8.CD31免疫组化染色提示,组织工程脂肪组(HAPA+ADSCs)新生血管最少,ADSCs辅助的脂肪移植具有一定的促血管新生效果,而HAPA辅助的脂肪移植(有或无ADSCs)促血管新生效果尤为明显(P0.05)。9.PerilipinA免疫荧光检测提示,HAPA可促进移植脂肪存活并可明显促进脂肪新生。10.Ki67及Tunel免疫荧光检测提示,HAPA能促进移植物内增殖细胞比例,而ADSCs及HAPA均可降低移植物内凋亡细胞的数量(P0.05)。11.不同HAPA/脂肪体积比的体内研究显示,纯脂肪组、10%HAPA组、20%HAPA组、30%HAPA组较40%、50%HAPA组具有更高的体积保留率(P0.05)。随着HAPA/脂肪体积比增大,移植物内脂肪完整性逐渐提高,而囊泡、纤维化程度逐渐降低(P0.05);12.CD31染色结果显示随着HAPA/脂肪体积比增大,新生血管数量逐渐增加,40%、50%组高于其余各组(P0.05),10%、20%和30%组高于单纯脂肪组(P0.05)。13.Perilipin A染色结果显示随着HAPA/脂肪体积比增大,移植脂肪细胞存活程度提高,并可见越来越多的新生脂肪细胞。结论1.无论常氧、低氧条件下,HAPA均能促进ADSCs增殖,且低氧条件下能促进ADSCs分泌VEGF并维持对ADSCs的诱导成脂分化作用.以上行为均可能参与HAPA促进游离移植脂肪存活的过程。2.HAPA能诱导原位脂肪新生、促进移植脂肪早期血管新生、促进移植脂肪存活、促进细胞增殖及抑制细胞凋亡,是游离脂肪移植中有应用潜力的生物材料。3.随着HAPA/脂肪体积比逐渐提高,移植脂肪存活程度也相应提高,但体积保留率逐渐下降。而本研究中,30%HAPA辅助脂肪移植可达到游离移植脂肪存活率和总体体积保留率最佳状态。目前仍需要更多的研究探索HAPA/游离脂肪最佳体积比。


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