收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白(curcin)的分离纯化、基因克隆及作用机理研究

林娟  
【摘要】: 麻疯树为大戟科麻疯树属植物,在我国的西南地区有着丰富的资源。麻疯树种仁中含有丰富的蛋白质,此蛋白质对人、小鼠及羊等是有毒的。以四川攀西地区采集的麻疯树为材料,分析了其种仁中总蛋白的含量和组成。采用硫酸铵分级分离和凝胶层析过滤法从麻疯树种仁中分离纯化出一种毒蛋白,称为麻疯树毒蛋白(curcin),其相对分子量为28.2kDa,等点电为8.54左右。Curcin是一种糖蛋白,中性糖含量为4.91%。Curcin远紫外圆二色谱(CD谱)显示217nm处的单一负峰,此时的curcin分子中含有22.3%的a螺旋,43.5%的β折叠和34.2%的无规卷曲和转角。使用ABI491A蛋白测序仪测定了curcinN端前32个氨基酸的序列为:A-G/Y-S/K-T/A-P/D-T-L-T-I-T-Y-D-A-T/A-A-D-K-K-N-Y-A-Q-F-I-K-D-L-R-E-A-F/A-G。当curcin浓度大于7.8mg/L时,具有凝集兔红细胞的活性。用纯化出的curcin制备出抗此毒蛋白的兔抗血清,并用ELISA技术和Western杂交技术鉴定了抗体的滴度和特异性。 Curcin对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC_(50)为0.19±0.011nmol/L;当curcin作用于大鼠肝核糖体经苯胺处理在3.5%聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳图上能观察到450bp的特征性核酸条带,从而证明curcin是RNAN-糖苷酶,它的作用机制是通过失活真核生物核糖体而抑制蛋白质的合成,因此认为curcin也是一种核糖体失活蛋白(RIPs)。体外生物学活性试验表明,curcin具有抑制胃癌细胞(SGC-7901)、小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)、人肝癌细胞(Human 四川大学博士学位论文 hePatoma)的体外增殖的能力,其 IC50分别为 0.23土0刀04 mg/L,0.66土0刀15 mglL和 3.1610.03 mg/L,但对 HeLa细胞和正常细胞无毒;在电脉冲介导下, curcin处理HeLa细胞后,细胞的存活率明显降低;显微镜下观察,可见到明显 的凋亡细胞,流式细胞仪测定细胞周期的*期前有亚二倍体的凋亡峰,DNA 凝胶电泳未显示有规律断裂形成的DNA梯状图谱;小鼠急性毒理实验结果表 明,小鼠灌胃半致死剂量LD扣为 104.737士29.447mg/kg;小鼠腹腔注射半致死 剂量 LD50为 67.20土 10.445 og/kg。 依据curcin的N-端部分氨基酸设计简并引物,通过反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)和快速分离cDNA末端(RACE)技术扩增得到curcin全长cDNA (Ge姻毗注册号 AY069946)。该 cDNA全长由N 73个碱基组成,包含一 个完整的编码 193个氨基酸的开放阅读框,构成一个 32 kDa的前体蛋白,成熟 蛋白由 251个氨基酸组成,前 42个氨基酸为信号肽,推导的多肽序列与已测出 的蛋白质的N.端序列相同。在起始密码子上游有一个由36个碱基组成的5’非 编码区;在终止密码子下游有一个由236个碱基组成的3’非编码区,包括两个 加 poly(A)信号和一个长度为 ZI个腺昔酸的 poly(A)尾。根据 curcin的 cDNA序 列设计引物,采用基因组步查技术克隆了麻疯树基因组中的一个 1802 hP DNA 片段(GenBank注册号 AF 469003)。序列分析结果表明,该基因也包含了同 上的开放阅读框,在5’端,除具有36个核昔酸外,还包含一个658核昔酸的5’ 上游序列,含有一个推测的TATA盒和两个CAAT盒;在丁端,也存在两个加 poly(A)信号,其序列有两处与CDNA基因不同。该基因的编码区具有核糖体失 活蛋白基因的特征:无内含子。 将编码 curcin的成熟蛋白(FLZ)和保守结构域(CB)基因定向克隆到 pQE-30质粒后,获得重组质粒pQE-JI(FLZ-pQE-30)和pQE-JZ(CBlpQE-30)。 用该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株。结果表明,在IPTG诱导条件下,编码 curcin成熟肽和保守结构域的基因都得到了表达。表达产物仍具有体外抑制蛋 白质合成的能力,蛋白质生物合成被抑制50%时的表达的融合蛋白的浓度r。 分别为 0.32土0.038 nmoUL(CBI)和 0.44士0.016 nmol/L(FLZ),说明成熟蛋 白N端的前8个氨基酸和C端后5个氨基酸对其活性无影响。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 林娟,颜钫,唐琳,陈放;麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究[J];高技术通讯;2002年11期
2 戎芳,王胜华,赵小光,郭亮,魏琴,唐琳,徐莺,陈放;麻疯树外植体愈伤组织中毒蛋白的Western-blot鉴定[J];四川大学学报(自然科学版);2005年01期
3 曾礼华,严钫,陈放;麻疯树叶提取物对鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用[J];中国家禽;2004年S1期
4 林娟,唐琳,陈放;麻疯树的组织培养及植株再生[J];植物生理学通讯;2002年03期
5 陈钰,魏琴,唐琳,陈放;麻疯树营养器官和种子的蛋白质组成及对水分和温度胁迫的反应[J];中国油料作物学报;2003年04期
6 魏琴,陆伟达,廖毅,潘树林,徐莺,唐琳,陈放;从麻疯树上胚轴外植体再生植株(英文)[J];植物生理与分子生物学学报;2004年04期
7 李维莉,杨辉,林南英,徐以礼,谢金伦;可再生能源麻疯树种子油化学成分研究[J];云南大学学报(自然科学版);2000年05期
8 林娟,陈钰,徐莺,颜钫,唐琳,陈放;麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达(英文)[J];Acta Botanica Sinica;2003年07期
9 孔令义,闵知大,史剑侠,冯锐;麻疯树根的化学成分研究[J];植物学报;1996年02期
10 韦松基,刘寿养;有毒药用植物的生药学研究[J];广西中医药;2002年05期
11 周锦霞,魏琴,周黎军,刘国金,陈钰,唐琳,陈放;麻疯树种子β-1,3葡聚糖酶的优化提取及其部分性质分析[J];西南农业学报;2005年03期
12 罗通;邓骛远;陈放;;不同产地麻疯树的抗冷性研究[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2006年04期
13 罗昌轶;张江平;;从农业比较效益看麻疯树生物能源产业的发展——以攀枝花为例[J];攀枝花科技与信息;2007年03期
14 王治涛;高帆;张淑文;秦晓波;徐莺;;麻疯树胚乳cDNA文库的构建与分析[J];四川大学学报(自然科学版);2007年01期
15 林娟,周选围,唐克轩,陈放;麻疯树植物资源研究概况[J];热带亚热带植物学报;2004年03期
16 张明生;樊卫国;尹杰;李金强;袁启凤;杨永华;;麻疯树资源概况及其开发利用[J];贵州农业科学;2005年06期
17 毛俊娟;倪婷;王胜华;陈放;;干旱胁迫下外源钙对麻疯树相关生理指标的影响[J];四川大学学报(自然科学版);2008年03期
18 宋莉英;窦新永;孙兰兰;彭长连;;高温下2种不同生态型麻疯树叶片光能利用和分配特性的比较[J];华南师范大学学报(自然科学版);2009年03期
19 范正琪;李纪元;田敏;李辛雷;陈东亮;卢孟柱;;麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶pepc基因全长cDNA克隆及序列分析[J];林业科学研究;2010年03期
20 张炜;罗建勋;辜云杰;胡庭兴;;西南地区麻疯树天然种群遗传多样性的等位酶变异[J];植物生态学报;2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 蒲彪;钟华;廖念禾;胡旭;;螺旋压榨法提取麻疯树籽油的工艺研究[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
2 胡会然;孙英成;杨志荣;孙群;;麻疯树枯萎病病原菌分离鉴定及室内药剂筛选[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3 陈放;;麻疯树生物柴油研究进展[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
4 钟华;蒲彪;胡旭;;超临界CO_2萃取麻疯树籽油工艺的响应面优化[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
5 王迎春;徐莺;陈放;;麻疯树油体脂肪酶基因的克隆和鉴定[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
6 马沅;王胜华;陈放;;麻疯树对经济作物烟草和玉米的化感作用[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
7 林娟;周明琦;金元杰;;麻疯树LEA基因的克隆和转化拟南芥的研究[A];全国植物分子育种研讨会摘要集[C];2009年
8 唐琳;陈丽;陈放;;麻疯树种子油的理化性质及脂肪酸组成分析[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
9 秦小波;徐莺;唐琳;陈放;;麻疯树胁迫诱导核糖体失活蛋白curcin—L启动子分析和转基因鉴定[A];2009中国植物学会植物细胞生物学学术年会论文摘要集[C];2009年
10 刘玉君;刘辉;陈晖;沈世华;;麻疯树种子油体蛋白质组学分析[A];第二届全国植物蛋白质组学学术研讨会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 林娟;麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白(curcin)的分离纯化、基因克隆及作用机理研究[D];四川大学;2002年
2 魏琴;麻疯树(Jatropha curcas)种子抗真菌蛋白及相关基因的分离、表达研究[D];四川大学;2004年
3 罗孟军;麻疯树毒蛋白curcin的表达、纯化、复性及体外活性和几丁质酶性质的研究[D];四川大学;2006年
4 卿人韦;麻疯树(Jatropha curcas L.)脂质合成的酶基因克隆及功能研究[D];四川大学;2005年
5 张颖;麻疯树水通道蛋白JcPIP2的分离、基因克隆及功能鉴定与调控分析[D];四川大学;2007年
6 陆志科;竹叶生物活性成分提取分离及其抗菌活性研究[D];中南林学院;2004年
7 王元凤;茶多糖的分离纯化、结构及构效关系研究[D];江南大学;2005年
8 徐金瑞;黑大豆种皮花色苷抗动脉粥样硬化及其抗氧化机制研究[D];西北农林科技大学;2006年
9 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
10 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙晴;麻疯树(Jatropha curcas)的RAPD分析与麻疯树毒蛋白在大肠杆菌中的表达[D];四川大学;2002年
2 戎芳;麻疯树(Jatropha curcas L.)外植体愈伤组织中毒蛋白(curcin)Western-blot鉴定及其烟草转基因研究[D];四川大学;2004年
3 陈漪;麻疯树籽仁粕蛋白对大鼠和猪的生物学效价研究[D];浙江大学;2010年
4 雷宝成;麻疯树开花结实习性研究[D];四川农业大学;2010年
5 陈钰;麻疯树(Jatropha curcas L.)蛋白质的分布、提取、保存及诱导蛋白的研究[D];四川大学;2004年
6 廖金旭;攀西地区麻疯树(Jatropha curcas Linn.)生物学特点和活性成分的研究[D];四川大学;2003年
7 赫春长;外源Ca对低温下麻疯树生理生化调节效应的研究[D];福建农林大学;2010年
8 黄永光;微生物对麻疯树饼粕毒蛋白的降解研究[D];贵州大学;2008年
9 邓骛远;麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白curcin2基因的原核表达[D];四川大学;2006年
10 陆伟达;麻疯树(Jatropha curcas L.)快繁及方差分析和四川药用植物网络数据库的构建[D];四川大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 洪宝光;麻疯树产业发展论坛在博鳌召开[N];海南日报;2008年
2 蒋艾丽;会理八万亩“生物油田”现雏形[N];凉山日报(汉);2007年
3 国家林业局 王桂芝;生物能源植物麻疯树初露锋芒[N];中国花卉报;2006年
4 周静;麻疯树将成“摇钱树”[N];凉山日报(汉);2007年
5 本报记者 张元忠 鲜荣 实习生 伊念;麻疯树炼油机遇几何[N];四川日报;2006年
6 李双民;绿化扶贫路子宽[N];市场报;2006年
7 记者 郭金凤;“云南南天”全面开发麻疯树资源[N];中国花卉报;2006年
8 张焰刚 记者 钟钢;国家下拨4400万元经费补贴麻疯树种植[N];人民政协报;2008年
9 蒋艾丽晏文金;会理大力发展麻风树造林初见成效[N];凉山日报(汉);2007年
10 李欣;麻疯树种子育苗如何操作?[N];中国花卉报;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978