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麻疯树(Jatropha curcas)的RAPD分析与麻疯树毒蛋白在大肠杆菌中的表达

孙晴  
【摘要】: 在四川攀枝花地区、凉山州和云南北部采集了7各居群的麻疯树(Jatrophcrocas L.)种籽样本。对样本萌发的幼苗进行了RAPD分析,同时探讨了实验条件的优化问题。针对RAPD标记影响因素众多、结果重复性低的特点,对RAPD分析中PCR扩增的各种条件进行了梯度测试,包括反应混合液成分、Taq酶量、引物浓度、模板浓度、PCR循环数等。得到了适于麻疯树RAPD分析的主要实验条件。在RAPD分析中使用了40个随机引物对7个样本进行分析,经重复实验,筛选出了5个多态性较为稳定的引物,测到49个位点,其中25个(51%)有多态性。根据任意二样本的共有位点数和扩增条带总数,算出样本两两之间的遗传距离,通过聚类分析得到7个样本的遗传关系,画出树状聚类图,为进一步研究攀枝花地区的麻疯树资源及其多样性打下了一定的基础。 在得到麻疯树毒蛋白cDNA序列后,通过PCR对毒蛋白基因进行了克隆,并实现了部分基因片段在大肠杆菌中的高效表达。设计特异引物克隆得到毒蛋白基因的4个片段,即基因全长、末端缺失片段、编码成熟肽的片段及编码活性区域的片段。通过定向克隆将片段插入表达载体,转化大肠杆菌后通过异丙基—硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,纯化后送交其它实验室进行活性测定,以用于与提取的毒蛋白进行活性比较。 实验中选用了两个表达系统,即QIAexpress(?)系统和谷胱甘肽S—转移酶(GST)基因融合表达系统。前者表达N—末端加6×His标记的融合蛋白,克隆到的4个基因片段均进行了表达,其中成熟肽和活性区域得到了大量表达,蛋白全长和末端缺失片段表达不明显。后者表达N—末端加GST的融合蛋白,用成熟肽编码片段进行了表达,发现表达量不及QIAexpress(?)系统,故将QIAexpression系统大量表达的二片段进行了纯化和活性测定。


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