水稻花粉profilin基因启动子的克隆及功能鉴定

【摘要】： Profilin基因是一种肌动蛋白结合蛋白，通过在不同条件下引起肌动蛋白纤维的聚合和解聚来调节细胞中肌动蛋白骨架的形成。叶秋等(2001)以成熟花粉为材料构建水稻花粉cDNA文库，从中筛选到profilin基因cDNA，Northern杂交和RT-PCR显示该基因在花药、花粉中特异表达，推测其可能在花粉萌发及花粉管伸长时期对肌动蛋白重新组合的信号转导和调控起重要作用。 通过两次染色体步移(Genome walking)的方法从籼稻IR36中克隆到长度为569bp的花粉profilin基因启动子片段PSP-P，并进行了全序列测定。运用多个数据库分析该段序列：在GenBank中的比对发现这段启动子序列定位于水稻第10号染色体上，同源性达96％；在EPD中的比较发现启动子上+1～-72bp的73bp序列与番茄花粉特异基因LAT52 61bp的启动子关键序列，向日葵花药特异基因SF2 60bp的启动子关键序列的同源性在50％左右，后两者之间的同源性也为50％左右。 PSP-P中含有三个TATA box，三个CAAT box，两个G-box以及多种顺式作用元件，表明该启动子序列对Profilin基因表达的调控可能具有多种时间性和空间性，这种调控可能具有花粉特异性。 实验将三条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别K 569bp，314bp，215bp)与β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)编码区连接，构建成双元嵌合表达载体(PSP-P1，PSP-P2，PSP-P3)，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化各时期的烟草花粉，快速鉴定PSP-P的花粉特异性以及片段中起关键作用的区域。结 叫川人学顾卜生学位论义 果显示PSPP3的GUS基因表达活性很低，只有约5％的花粉呈现深蓝色， PSPPZ的GUS基因表达活性要高很多，约80％的花粉被染成深蓝色。在 PSP－PI转染的花粉中没有检测到GUS基回表达活性。PSPP 驱动下的GUS 基因在成熟花粉及花粉管中均有表达。