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1.石蒜凝集素的纯化、性质及构象研究 2.单子叶石蒜科植物朱顶红和风雨花甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

吴传芳  
【摘要】: 本文对石蒜凝集素的研究主要包括纯化、性质、活性以及结构几个方面。石蒜(Lycoris radiaca)球茎经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀得到粗品,将粗品过阳离子交换柱(CM-Sepharose)、阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)和SephacrylS-100分子筛层析得到凝集素纯品。经SDS-PAGE检测为单一蛋白带,亚基分子量为12KD,SephacrylS-100凝胶过滤测得其表观分子量为45KD,表明LRA是由四个相同亚基组成的蛋白。LRA能凝集兔血细胞和大肠杆菌,其凝集兔血细胞和大肠杆菌细胞的效价分别为0.95 ug/mL和1.9ug/mL,对外周血淋巴细胞具有很强的促有丝分裂能力;糖抑制实验结果表明,甘露聚糖和甲状腺球蛋白能抑制LRA的凝血活性;对酵母细胞的凝集实验表明,LRA能凝集啤酒酵母细胞;在抗病毒活性方面,LRA能有效地降低Ⅱ型人类单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的感染,在500ug/mL时对正常Vero细胞无细胞毒性,IC_(50)=5~10ug/mL之间;在抗爱滋病病毒实验中,LRA能有效降低HIV-1和HIV-2对HT-4和CEM细胞的感染,LRA对HIV-1的半抑制浓度EC_(50)分别为0.43ug/mL和0.79ug/mL,对HIV-2的EC_(50)分别为0.60ug/mL和0.59ug/mL,而LRA对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度为71ug/mL,表明LRA是一种有效的抗病毒蛋白。 LRA的远紫外圆二色谱显示222nm处的单一负峰,208nm和238nm处的肩,此时的LRA分子是一种特异性的高β-折叠蛋白质。LRA的荧光光谱研究表明在激发光波长为280nm时,其最大荧光发射峰在338nm处,荧光光谱未见有酪 氨酸(Tyr)残基的发射峰,表明Tyr残基的荧光基本上通过能量转移到TrP 上,使荧光强度增强,在激发光谱为295nm时,其最大荧光发射峰338nm,比 游离TrP的最大荧光发射峰(348lun)蓝移了近10nln,说明TrP周围的极性较 弱,处于疏水的微环境。研究不同温度、PH和基团特异性化学修饰后LRA凝 血活性和促淋巴细胞有丝分裂的变化、圆二色谱和荧光光谱的变化,当温度达 80℃以上时,活性开始下降,到100℃时活性有60%保留:当pH为2时,活性 保留50%,pH为4一12对活性的影响不大;用NBS修饰TrP后,T即的旦一叫睬 基的破坏使活性完全丧失,表明TrP对凝血活性是至关重要的,Arg、Tyr、 Glu、Asp被修饰后,LRA的凝血活性并未受到大的影响,但Tyr修饰后LRA的 促有丝分裂活性降低.用DEPC对组氨酸的p一咪哇基进行特异化学修饰后,其 凝血活性有明显的下降,表明p一咪哇基是凝血活性的必需基团。而圆二色谱 的研究表明结构的变化先于活性的变化,先是结构开始变化,但活性中心结构 并未破坏,接着结构的进一步变化使活性逐步丧失,表明LRA具有较强的抗变 性能力。研究了不同温度、pH和特异化学修饰后LRA的荧光光谱变化,发现 温度的升高和PH的改变对荧光光谱影响不大,Tyr的修饰使荧光强度降低; 丙烯酞胺、KI和氯化艳均能够使LRA的荧光淬灭,丙烯酞胺能淬灭93.6%色氨 酸残基的荧光:用NEM做修饰剂测定LRA的可反应疏基数和总琉基数,发现 LRA中不含琉基,用比色法测定LRA中TrP的含量为5.3%,用NBS修饰时,测 得每分子LRA中含有12.4个TrP残基,即每个亚基约含3个TrP残基。


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