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玉帘凝集素的分离纯化、部分性质研究及分子克隆

吕辉  
【摘要】: 本文对玉帘凝集素(Zephyranthes candida Herb Agglutinin,ZCA)的研究分为两个部分。第一部分为ZCA的分离纯化及部分性质研究;第二部分为ZCA的分子克隆及序列分析。 玉帘球茎经捣碎、生理盐水浸取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-100分子筛层析可纯化到ZCA纯品,经SDS-PAGE检测为单一蛋白染色带。Sephacryl S-100分子筛凝胶过滤测得ZCA的表观分子量为48KD,SDS-PAGE显示其亚基分子量约为12.5KD,证明ZCA分子为由四个相同亚基组成的四聚体,用比色法测得每分子ZCA含有12.2个色氨酸残基,即每个亚基有3个,且色氨酸残基均位于分子表面或浅沟内。 ZCA具有很强的兔血凝集活性,在浓度为0.95μg/ml时仍能凝集兔红细胞,同时ZCA还具有凝集大肠杆菌和多种酵母细胞的作用。甘露聚糖和猪甲状腺球蛋白对ZCA的兔红细胞凝集活性有明显的抑制作用。研究了不同温度和pH对ZCA的荧光光谱和兔血凝集活性的影响,结果表明温度在80℃以上时分子构象发生了较大变化,但凝血活性仍保留50%的活性;在pH 4和pH 12时分子构象发生较大变化,但凝血活性只下降了27.3%,在pH 2时,凝血活性仍保留55%。所以ZCA具有很强的温度和pH耐受性。 荧光淬灭研究表明CsCl可以淬灭71%色氨酸的荧光,化学修饰实验表明N-溴代丁二酰亚胺(NBS)修饰色氨酸和2,3-丁二酮修饰精氨酸后,ZCA凝血活性明显下降,Ser/Thr被修饰后,凝血活性无明显变化。ZCA抗病毒实验结果表明,ZCA溶液在浓度为500μg/ml时无细胞毒性,浓度为5μg/ml以上时有 抗HSV一11活性,ICS。=5一1 op岁ml之间。 使用妞工49lA蛋白测序仪测定Z以的N一端和C一端部分序列显示,N-末端 前巧个氨基酸的序列为:D一S一I一L一Y一S{一E一T一L一S--A一司一S,C一末端7个氨基 酸残基的序列为:G一T一A礴--K一P.与石蒜科其它甘露糖结合凝集素序列进行比 较,发现有较高的同源性. 依据ZCA的N一端部分氨基酸设计简并引物,通过反转录、RT一CR与3’- 末端快速扩增法(3’一RACE)和5’一末端快速扩增法(5’一RACE)扩增得到 ZCA全长eDNA(Genbank注册号AF503622),该。DNA全长为661bp,开放阅读 框从40一543bp,长504bp,编码168个氨基酸。起始密码子位于37一39bp处, 终止密码子位于544一546bp处。5’端非翻译区长为94饰,其后还有一段真核 生物mRNA所特有的poly(A)序列。根据对Z以的N一末端和C一末端部分氨基 酸序列的测定,发现Z以基因编码一前体蛋白:含有信号肤序列、成熟蛋白序 列和C一末端剪切序列。成熟蛋白由106个氨基酸残基组成,分子量为11甲7KD。 经在NCBI上的Blast进行比较发现,该成熟蛋白编码氨基酸序列与雪花莲凝 集素(GNA)同源性达到75.2%,与水仙凝集素同源性为72.4%;与石蒜凝集 素同源性为76.2%,与君子兰凝集素同源性为76.2%。在blocks数据库 (~blocks.伍crc.org)中检索zCA蛋白氨基酸序列的结构域,发现zCA氨 基酸序列中存在三个凝集素功能结构域区,并具有3个典型的甘露糖专一结合 位点盒(QDNY)。成熟蛋白质序列中,疏水氨基酸占38.7%,亲水氨基酸占43.4 %,碱性氨基酸占10.4%,酸性氨基酸占75%。Z以的信号肤包括24个氨基 酸,其中含一个9个氨基酸组成的疏水核心。由DNA PCR实验可知,ZCA 基因的编码区无内含子。此基因的克隆,为深入研究ZCA结构基因,剪切机 制,表达和调控机制以及ZCA结构和功能的关系莫定了重要的基础。


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