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《四川大学》 2003年
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工蜂酸性磷酸酶的分离纯化及性质研究

江琰  
【摘要】: 从意蜂工蜂体内分离提纯到酸性磷酸酶(ACPase,E.C.3.1.3.2),对其性质进行了较全面的研究。首先比较ACPase在工蜂、雄蜂虫蛹、蜂蜜、蜂王浆等材料中的活力大小。再将工蜂ACPase的初提物经分段盐析、DEAE-Sepharose F.F离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤等纯化步骤,得到经聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶制剂。提纯倍数77.24,酶液比活力为16.22U/mg蛋白(对硝基苯磷酸二钠作底物)。用动力学方法测得该酶最适pH为4.1,最适温度52℃。以对硝基苯磷酸二钠为底物测得Km值为1.25×10~(-3)mol/L。酶在50℃保温30min活力保持在60%以上。利用凝胶过滤法测定酶的表观相对分子质量为135kDa,SDS-PAGE测定酶的亚基相对分子质量为63.1kDa。酶的等电点为4.46和4.79。非还原/还原(NR/R)单向、双向SDS-PAGE显示酶分子含有链内二硫键。对二级结构圆二色谱(CD)分析显示,酶分子中α-螺旋占13.84%;β-折叠占25.68%;无规则卷曲占56.34%。氨基酸组成分析结果表明:ACPase约含有507个氨基酸,富含天门冬氨酸残基。 选择Zn~(2+)、Mg~(2+)、K~+、Pb~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)八种金属离子和脲作用于ACPase,发现Zn~(2+)、Mg~(2+)、K~+对该酶有明显激活作用。Cu~(2+)、Fe~(3+)、Cr~(3+)对该酶有较强抑制作用。Pb~(2+)在低浓度时有微激活作用,高浓度时具弱抑制作用。Cd~(2+)比Pb~(2+)对该酶活性影响更小。蛋白变性剂脲能使酶失活。利用双倒数作图法研究Cu~(2+)、Cr~(3+)、Fe~(3+)对酶的作用,结果表明 这些离子对酶的抑制作用为非竞争性抑制类型,用Dixon作图法求出其抑 制常数犬i值分别为3.58xlo一3mol/L,3.25、10一4mol/L和6.15、10一4mol/L。研 究这些物质对酶的紫外光谱的影响,结果表明:随zn2+浓度增加,酶的紫 外吸收峰位置不变,强度增加;随Mg2+、K+浓度增加,吸收峰位置不变, 强度减小;随cd2+浓度增加,吸收峰强度增加,最大吸收波长红移;随Pb2+ 浓度增加,酶的紫外吸收峰逐渐消失;cu2+、Fe3+、cr3十对酶的紫外吸收光 谱影响较大,低浓度条件,其紫外吸收光谱特性消失,特征吸收峰也消失。 脉使酶的紫外吸收峰强度增大。 研究化学修饰剂二琉基苏糖醇(DTT)、对氯汞苯甲酸(pCMB)、N- 澳代唬拍酸亚胺(NBS)、苯甲基磺酞氟(PMSF)、澳代乙酸(BrAc)在 不同浓度,不同时间条件下对酶活力的影响以及荧光光谱变化。结果表明: 半肤氨酸残基的琉基和二硫键被修饰后,酶活力下降且荧光强度减小;色 氨酸残基被修饰后酶活力减小,荧光强度降低;含经基的氨基酸残基被修 饰后酶活力降低,荧光强度增加;组氨酸残基被修饰后酶活力基本不变, 酶的荧光强度也不改变。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S891

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