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《四川大学》 2003年
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牛蛙生长激素基因克隆及其表达效应研究

龙章富  
【摘要】: 动物生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体间叶细胞分泌的一种多肽激素,具有调节生长发育,参与体内代谢调节,增进食欲,提高食物转化率等作用,然而垂体中生长激素含量极低,分离纯化比较困难,使得生长激素生理功能的进一步研究和应用受到限制。随着现代生物技术的发展,基因重组生长激素应用于研究和生产已经成为可能。研究表明,基因重组的生长激素与天然的生长激素一样具有生物活性,但重组生长激素蛋白应用于生产仍存在用量大、成本高、效果稳定性差等缺点。 随着DNA疫苗研究的不断深入,质粒肌肉注射动物被证实能增强动物的免疫能力,但生长激素基因在动物体内的转染表达研究却极少报道。本研究首次以两栖动物牛蛙为研究对象,进行了其生长激素基因的克隆以及原核表达质粒与真核表达重组质粒的构建、重组牛蛙GH蛋白的生物活性和免疫活性检测以及重组蛋白制剂和核酸制剂的制备及其体内促长作用等表达效应研究,研究目的在于求证重组真核表达质粒是否能在牛蛙中表达、其促长效应是否强于重组BfGH蛋白,为探索重组生长激素真核表达质粒能否替代重组GH蛋白作为动物促长基因制剂等研究奠定理论基础。 首先,以成体牛蛙的脑垂体总RNA为模板,进行RT—PCR扩增得到约660bp的特异性PCR产物带,切下琼脂糖凝胶中的特异产物带进行cDNA胶回收,将cDNA与pMD18—T载体进行T—A克隆连接并转化到DH5α E.coli后,进行菌落PCR、质粒酶切鉴定,筛选出阳性菌株,测序结果经BLAST分析,与已报道的牛蛙生长激素基因高度同源,证实此阳性克隆为牛蛙生长激素基因转化子,命名为pBfGH。克隆得到的牛蛙生长激素基因BfGH编码215个氨基酸残基,分子量为24.9KDa,等电点为7.77;疏水氨基酸37.7%,亲水氨基酸35.8%,碱性氨基酸14.9%,酸性氨基酸11.6%。其1-25aa为BfGH信号肽序列,与已有报道的牛蛙GH信号肽序列完全一致;26—215aa为成熟肽序列。BfGH与Pan等(1988)报道的牛蛙GH相比在蛋白质序列(CAA31038,JS0037)有94%的同源性,与 四川人学博士学位论文 Takahashi等(1 992)报道的牛蛙GH蛋白序列(AAB24792)的同源性为 97%,与Koboyashi等(1 991)报道的牛蛙GH蛋白序列(AAB 1 9425)的同源 性为95%。本研究克隆的牛蛙生长激素基因B幻H己在GenBank登记 (AY25 1 538)。 采用双酶切牛蛙GH基因cDNA片断和原核表达载体pGExl一灯, 将BfGH cDNA定向插入到pGEXI一入T,经酶切鉴定后进行IPTG诱导表 达研究。表达研究结果包括三方面,一是重组pGBfGH在大肠杆菌中表 达的融合蛋白分子量为SO.gKDa,符合推导分析的预期大小;二是诱导条 件的优化,在添加lm叨L IPTG诱导表达3hrs就能得到高效表达,经定 量分析,牛蛙生长激素基因在大肠杆菌中的表达量可达到菌体总蛋白的 29.3%;通过比较不同诱导时间和不同浓度的诱导剂用量等研究,结果表 明在IPTG浓度为0.1 mM几时,37℃诱导表达4hrs,其表达量与lmM几 浓度的IPTG,37℃诱导表达3hrs的表达量一致,这为大量表达生产重组 牛蛙GH蛋白时降低IPTG用量、从而降低生产成本提供了理论依据。三 是重组B佑H在大肠杆菌中的表达以形成包涵体的形式存在。 通过回收原核表达的牛蛙GH重组蛋白(re一BfGH),并制备抗BfGH 的兔抗高免血清,采用牛蛙肝受体膜蛋白为吸附受体,以回收的重组牛蛙 生长激素融合蛋白为抗原,兔抗BfGH高免血清为一抗,辣根过氧化物酶 标羊抗兔IgG(HRP一IgG)为二抗,进行ELISA一RA检测,验证了回收 的重组牛蛙生长激素融合蛋白具有较强的生物活性和免疫活性。 以VR1020为载体,构建了牛蛙GH真核表达质粒VBfGH、草鱼GH 真核表达质粒vgcGH,并以脂质体为载体进行了cos7细胞转染表达实验。 在转染24一72hrs后,对抽提的转染细胞总RNA进行RT一PcR检测一发现, 转染24hrs VB价H在Cos7细胞中即有转录,并在72hrs时转录量最强; 以转染细胞培养液为抗原进行ELISA一RA检测,转染24hrs、48hrs、72hrs 的牛蛙生长激素表达量分ZIJ为25.4ong/ml,58.67ng/ml和73.47ng/ml。 为进一步验证牛蛙重组生长激素蛋白和真核表达质粒转染表达对牛 蛙的生物活性,进行脂质体包裹重组re一B仍H蛋白、脂质体包裹VBfGH 质粒、脂质体包裹草鱼GH真核表达质粒vgcGH、脂质体包裹vR1020 质粒对牛蛙体内促长效果的比较研究,并以脂质体包裹生理盐水为对照, 研究结果表明,脂质体包裹重组BfGH蛋白、脂质体包裹VBfGH质粒、 VgcGH质粒和VR1020质粒均较对照组有明显提高牛蛙血清GH含量的 作用,但以脂质体包裹重组:e一BfGH蛋白、牛蛙GH真核表达质粒VBfGH 脂质体包裹组的效果最佳,血清GH含量的差异和增重幅度与对照达显著 水平。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q786

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