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《四川大学》 2003年
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番红花(Crocus sativus)八氢番茄红素脱氢酶CsPDS基因的克隆、表达及含西红花甙资源植物的研究

白洁  
【摘要】: 番红花(Crocus sativus L.)系鸢尾科(Iridaceae)番红花属(Crocus)球茎类草本植物。由于富含的类胡萝卜素使其具有鲜亮的颜色、特殊的香味,因而被用作食品添加剂、天然色素、香料和染料外;番红花也是一种珍稀名贵中药材,具有抑制肝炎病毒、增强免疫、治疗或预防心脑血管疾患和抗癌的功效。其中主要的活性成分是西红花甙,需经类胡萝卜素代谢途径合成,而八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)是此途径中的一个早期关键酶。 本文对番红花资源的研究概况进行了概述,并依据GenBank中八氢番茄红素脱氢酶基因的保守序列设计简并引物,通过反转录聚合酶链式反应和快速分离cDNA末端技术从番红花柱头中扩增得到了八氢番茄红素脱氢酶基因的全长cDNA(GenBank AY183118)。该cDNA全长2149bp,包含一个1697bp的开放阅读框架,编码565个氨基酸。在起始密码子上游有一个由59个碱基组成的5’非编码区;在终止密码子下游有一个由391个碱基组成的3’非编码区,包括4个分解信号、1个加尾信号和1个长度为17个腺苷酸的poly(A)尾。经BlastP发现,其一级结构与水仙等植物的八氢番茄红素脱氢酶同源性高,并且在编码区N端附近具有八氢番茄红素脱氢酶基因的特征:FAD保守结构域。由此可认为该番红花八氢番茄红素脱氢酶基因在结构上与其它植物八氢番茄红素脱氢酶基因是同源的,是八氢番茄红素脱氢酶基因家族中的一个新成员。Southern印迹表明该基因在番红花柱头中以单拷贝形式存在。Northern印迹 四川大学博士学位论文 表明,八氢番茄红素脱氢酶在番红花成熟组织中柱头、雄蕊的表达强于叶和茎。 此基因的克隆,为深入研究八氢番茄红素脱氢酶基因结构、表达和调节机制及 其结构和功能的关系奠定了重要的基础。 用PCR方法扩增番红花八氢番茄红素脱氢酶(PDS)编码区序列,定向克 隆到表达载体pET一艺1a(+)上,获得重组质粒pET一21a(+)/CsPDS。经工PTG诱导, 重组质粒在点co力‘BLZI中表达出了C端融合了6 x His的融合蛋白,过量表 达的蛋白主要以不溶性蛋白形式存在,其表达量占菌体总蛋白的9.8%。用 SDS一尸AGE和we、te:!:印迹检测分析表明,表达产物的分子量约为63kD。利用 His6技术分离纯化融合蛋白,纯度可达90%以上。用纯化蛋白免疫家兔,制得 滴度为IJ的抗血清。Western印迹显示所制得的抗血清只能与63kD的融合蛋 白发生特异的免疫反应;并表明各组织中成熟柱头的八氢番茄红素脱氢酶有较 强表达,而且在柱头中,其表达随着组织发育的进程而增强。 利用尸C尺技术克隆了番红花八氢番茄红素脱氢酶(尸DS)编码区序列,经 测序鉴定后,将番红花的八氢番茄红素脱氢酶基因构建入含内含子Km筛选标 一记的植物双元表达载体pB工121中,在CaMV35S组成型启动子和T一n。S终止子 的控制下,构成了番红花的八氢番茄红素脱氢酶基因的植物表达载 pBI一2一CSpoS。利用根癌农杆菌栩岁刁baerer了二t二。fae了即‘)(EHAIOS)介 导的叶盘转化法对模式植物烟草进行乙污几万基因的转化,叶盘经农杆菌浸染以 后,在含卡那霉素的MS:培养基上诱导丛生芽,丛生芽在M乳培养基上诱导生根, 生根率达到93%左右,最后将再生苗移栽到土壤中培养,成活率100%。再生苗 经过戍R和PCRS。::hern bl。t分子检测证明获得了烟草转基因植株。最终转 化率约为68%。 对番红花属番红花的核糖体55一rR肤基因序列进行基因克隆、测序,获得 了的55一rRNA基因的序列特征。其55一rRNA基因间区约550bp,经比较番红花 与其混淆品的核糖体55一rRNA基因序列,并用软件分析,发现可利用凝胶电泳、 测序比较碱基差别和采用反oR工酶切55一rRNA基因间区的PCR产物进行番红 花和同属植物、伪品的鉴别。 从资源开发角度出发,本文根据薄层层析、紫外可见光光度检测法研究了 密蒙花中西红花试的提取方法,同时采用RP一HPLC法建立了密蒙花黄色色素提 取物中西红花试一l含量的测定方法。色谱条件为色谱柱:Spheri Sor匕一C18柱 四川大学博士学位论文 (sum,25Omm x 4.6mm);流动相:甲醇一乙睛一水,检测波长:437 nm。加样回 收率在99%以上,了卯小于l%。本法适用于密蒙花中西红花贰一1的含量测定。 以密蒙花芽、幼叶、茎段为外植体,在B5、MS、Wh 1 te培养基上获得愈伤 组织。以幼叶诱导为佳,并筛选出愈伤组织最佳培养基为BS+6一BA 0.smg/L+2,4一0 0.5!ng/L;最佳继代培养基为BS+6一BA 0.smg/L十N从0.smg/L; 分化培养基为BS,6一BA lmg/L十NAA 0.lmg/L+G A 0.lmg/L;生根培养基l/ZMS 十NAA 0.2 mg/L或l/ZMS+NAA 0.6 mg/L。幼苗移栽后成活率达100%,并于 当年开花。同时建立了以密蒙花幼芽获得快繁苗的最佳培养基组合,其中不定 芽诱导培养基为BS‘6一BA lmg/L‘NAA 0.lmg/L+G A 0.lmg/L;不定芽增殖培养 基为BS十6一BA lmg//L十NAA 0.Zmg/L和BS十6一BA Zmg/L十NAA 0.Zmg/L:生根培 养基为l/ZMS十NA六0.2 mg/L或1/2MS十NAA 0.6 mg/L。 利用尺A尸D技术和55一眼NA基因序列间隔序列分析为基础的DNA分子鉴定方 法,获得了用于鉴定密蒙花及其混淆品的分子指纹图谱和55一r
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785

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