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《四川大学》 2004年
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富铁酵母工程菌的构建及细胞中铁的生物转化、分布和结合状态的研究

袁玉兰  
【摘要】:铁是人体及动物生长必需的营养元素,是血红素、肌红蛋白、细胞色素等的重要组成成分。铁的缺乏会引起人及动物缺铁性贫血及一些其他相关疾病。自然界中虽然含有丰富的铁元素,但多以不溶性铁盐的形式存在,人体对其吸收率很低。酵母细胞具有富集微量元素包括铁的能力,可以转化无机化合物为有机化合物,有较高的生物利用率且安全性好。利用酵母富集微量元素的研究已成热点。主要研究结果如下: 1.不同的酵母菌株富集铁的能力有很大差异,目前研究者主要是通过自然筛选获得细胞铁富集能力较高的菌株。而在野生型酵母菌株中,细胞的生长和细胞铁富集量之间常存在一定的矛盾,很难通过自然筛选和诱变获得生物量和铁含量均较高的菌株。本文通过对实验室保存菌株进行筛选、单倍体分离、化学诱变(DES)、最终通过原生质体融合技术,获得结合了亲株优良特性的、遗传稳定的高生物量富铁酵母菌株ZYF-15。其细胞总铁含量明显高于亲株,分别是原始亲株ZY-46和ZY-173的1.7倍和1.3倍。 2.较系统地进行了富铁酵母菌ZYF-15发酵条件的研究。确定摇瓶优化发酵条件为:葡萄糖80g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉10g/L,初始pH7.0,装液量50mL/250mL,接种量10%,Fe~(2+)添加量600μg/mL,30℃发酵30h。在此优化条件下,细胞生物量(干重)达11.2g/L,细胞铁含量达24.5mg/g干细胞,其细胞总铁含量是初始培养条件的1.5倍。通过正交试验显示,葡萄糖浓度是影响细胞生物量的最主要因子,铁盐浓度是影响细胞铁含量的最主要因子,而蛋白胨浓度是影响细胞总铁含量的最主要因子。以上述摇瓶实验为基础,确定了5L自动发酵罐适宜的发酵工艺条件:装液量3L,控制溶氧量25%, 四川大学博士学位论文 接种量20%,控制pH)4.5,30℃下发酵16h。在此条件下细胞生物量(干重) 达9.3留L,细胞铁含量达39.8m留g干细胞,细胞总铁含量比摇瓶实验结果提 高了约1.4倍。 3.研究分析和探讨了富铁酵母细胞将富集的无机铁转化成有机铁的有机 化程度、铁在细胞中的分布情况及结合状态。酵母细胞在添加有600 oghaLFe2+ 的培养基上经培养后吸收的铁约为45.7%,富集的铁中约有97.6%转化为有机 铁,其中有相当数量的铁与DNA、RNA和蛋白质发生了结合。细胞富集的铁 主要分布在细胞壁和液泡中。 4.在发酵工业中,酵母菌细胞的絮凝在酿酒、乙醇等生物制品的制备过程 中具有重要意义。有研究表明,絮凝性酵母具有吸附金属离子的能力。为此构 建了以铜抗性为筛选标记、含有絮凝基因的大肠杆菌一酵母菌穿梭整合表达质 粒。将带有多拷贝絮凝基因重组质粒和构建的上述整合质粒引入到富铁酵母菌 ZYF一巧中。初步探讨了絮凝基因对细胞铁富集能力的影响。具体结果如下: 从穿梭重组质粒pCF一1上经酶切获得絮凝基因(FLOIG)片断,此片断与大 肠杆菌一酵母菌穿梭整合载体YIPS连接并转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒 PIF。然后以质粒pIF为基础,将铜抗性基因表达框(CuPIp确了刀)插入质粒pIF 中,转化大肠杆菌DH5a,获得了以铜抗性为筛选标记的整合表达质粒pIFC。 将实验室保存的附加体型重组质粒pEF一1和上述构建的质粒pIFC分别转化富 铁酵母菌ZYF一15,获得了带有多拷贝絮凝基因的重组菌株ZYEF和整合到菌 株ZYF一15染色体上〔仄注3基因座的重组菌株ZYIFC。研究显示,絮凝基因在 菌株ZYF一巧中的表达具有累加效应,即随基因拷贝数的增多,絮凝程度加强, 对铁的富集能力也增强。重组菌株ZYEF和ZYIFC均能明显增强细胞对铁的富 集能力,其细胞总铁含量分别是ZYF一巧的1 .5和1 .3倍。 富铁酵母菌株ZYF一15具有较好的富集铁与转化铁的能力,可作为食品强 化剂和饲料添加剂的铁源,在工业化生产上具有一定的开发和应用价值。将絮 凝基因引入富铁酵母中将为进一步研究其在工业生产中的应用奠定理论基础。 关键词:酵母菌:原生质体融合;生物量;铁含量;发酵条件;生物转化; 絮凝:基因表达 了
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ92

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【二级引证文献】
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10 张博润;姜书勤;徐婉学;金喆;刘淑敏;鲁玉瓦;汪和睦;武延宽;阎惠芳;杜鹏;;相同交配型酵母原生质体电融合及融合体的分析[J];生物工程学报;1986年04期
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8 陈美龄;全细胞脂肪酶生物催化剂的构建及其在生物转化中的应用[D];浙江大学;2012年
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4 李瑞娟;球形红细菌生物转化槲寄生指纹图谱及化学成分的研究[D];山西医科大学;2010年
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6 梁艳;两种植物培养体系对4-苯基香豆素的生物转化研究[D];暨南大学;2011年
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