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《四川大学》 2004年
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可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究

刘柱  
【摘要】:从被草甘膦极度污染的上壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7。它能在900mmol/L草甘膦的限制性培养基Mops上生长。表型及16S rDNA鉴定其为可变盐单胞菌。 从可变盐单胞菌HTG7构建的粘粒基因组文库中克隆到一个完整的基因,能恢复EPSP合酶缺陷型菌株E.coli ER2799在限制性培养基中的生长能力,并能在草甘膦浓度为80mmol/L的Mops液体培养基中良好生长。基因全长1350个碱基对,核苷酸序列与目前已报导的编码EPSP合酶的aro A基因几乎没有任何同源性,氨基酸序列与草甘膦抗性相关的美国专利所涉及的22种微生物EPSP合酶的同源性在46%以下。利用生物信息学方法,对编码产物进行亚细胞定位,还对其保守结构域、蛋白水解酶的切割位点、蛋白的二级结构、疏水区及跨膜区进行分析预测,所有结果表明我们所克隆的是一个结构新颖、功能明确并高抗草甘膦的新基因。本基因已在GenBank中注册,登录号为AY573186。 新基因与pE7-28a(+)构建了N-端带有HiS·Tag和T7·Tag的融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),30℃能诱导可溶表达。SDS-PAGE显示表达物分子量为51kD;蛋白通过镍离子螯合柱得到了纯化。Western Blot表明经纯化的蛋白可以与检测试剂盒中的抗体特异结合。酶活实验证明表达产物有EPSP合酶的活性。 为了寻找EPSP合酶中某些与草甘膦抗性相关的位点,利用错误倾向PCR技术,对可变盐单胞菌HTG7的EPSP合酶基因进行随机PCR扩增,通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coli ER2799的互补筛选,获得了2个不具有 四川大学博士学位论文 草甘磷抗性的EPSP合酶突变体。l号突变体EPSP合酶编码区与突变前基 因相比,核营酸2‘ST变为2‘SG,导致氨基酸残基8,v(密码GTG)变为82G (密码GGG);核营酸‘2,3T变为”,3G,氨基酸残基‘3,V没发生改变。2号突 变体EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核普酸‘79A变为‘79G,导致60Q (密码CAA)变为6限(密码CGA);核昔酸‘02A变为日0zT,导致氨基酸2啊 (密码ACC)变为26日S(密码TCC);核昔酸8,,T变为8、,导致氨基酸2,‘v (密码GTT)变为2,ID(密码GAT);核营酸669G变为669A,氨基酸残基223L 没发生改变;核普酸“34T变为“34A,氨基酸残基378G没发生改变。 对突变前后的EPSP合酶进行比较预测,发现突变前后氨基酸位点肤 平面和N原子之间形成的扭转角度存在一定的差别。这些结果表明酶的功 能主要由中心骨架决定,而肚平面和N原子之间角度的变化,造成高级结 构构象细微的差别,致使草甘磷抗性功能的丢失。 关键词:可变盐单胞菌,草甘麟抗性,Epsp合酶,aro月基因 原核表达,错误倾向PcR突变,结构预测,
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q78

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