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《四川大学》 2004年
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植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理研究

谢晶  
【摘要】:在农业生产过程中,植物病原真菌和细菌很易感染植物,每年因此而造成数千万元的经济损失,如何控制疾病、维持植物的正常生长一直是科研工作者研究的热点。化学农药可以有效的控制真菌和细菌病害,在植病防治上发挥了巨大的作用。但是随着人们对化学农药更多的认识,比如它引起土壤、水体和大气的污染,农副产品中农药残留增加,直接危害了人类的健康及生存,以及病原菌的抗药性等问题,致使许多农药的使用受到了限制,由此加速了人们去寻求新的安全有效的植物病害防治途径。利用自然环境中的拮抗微生物防止植物病原的侵袭,也就是我们说的生物防治,这样不仅可以避免象化学农药引起的抗药性问题而且对环境和人类健康都是安全的。 本研究用稀释分离法对成都、简阳、雅安等地区的农田、自然保护区的13个土壤样品进行放线菌和细菌的分离,共分离到放线菌119株,细菌67株。以玉米弯孢菌为供试菌,采用传统五点对峙法和改良的点对峙培养筛选法对80株放线菌进行筛选,结果显示,前者在同步培养5天时间筛选出具有拮抗活性放线菌14株,后者在同步培养5天时间筛选出具有拮抗活性放线菌21株,由此确定改良点对峙培养筛选法适宜病原真菌拮抗性放线菌的筛选。用改良的点对峙培养筛选法从119株放线菌筛选出对病原真菌有拮抗作用的放线菌共39株,用传统的点对峙法从67株细菌中筛选出对病原真菌都有拮抗作用的细菌5株,即BS04、ST1、ST8、C3和C4。其中对山葵墨入菌有拮抗活性的放线菌36株,玉米弯孢菌的拮抗放线菌29株,水稻纹枯病菌的拮抗放线菌27株,玉米小斑病菌的拮抗放线菌28株,玉米大斑病菌的 拮抗放线菌28株,小麦赤霉菌的拮抗放线菌25株,玉米圆斑病菌的拮抗放 线菌27株,枯斑拟盘多饱菌的拮抗放线菌27株,交链抱的拮抗放线菌25株。 用改良的琼脂扩散法从119株放线菌和67株细菌筛选对病原细菌有拮抗作 用的放线菌1株,编号为Pll,且只对姜瘟青枯假单胞菌有作用,筛选到拮 抗细菌4株,其中BS04、STI、STS对柑桔溃疡病菌和姜瘟青枯假单胞菌均 有拮抗作用,P18只对柑桔溃疡病菌有拮抗作用。 由于拮抗菌 BS04对病原真菌和细菌都具有很好的拮抗作用,具有作为生 防制剂的潜力,故对其进行了深入的研究。传统的细菌系统鉴定方法鉴定拮抗 菌BS04结果发现,BSO4与多粘芽抱杆菌和多粘类芽抱杆菌都很相似,无法精 确确定其分类地位。采用165 rDNA序列分析方法从分子角度确定拮抗菌BSO4 的分类地位,结果表明细菌BS04的165 rDNA的序列与类芽抱杆菌属细菌有很 高的同源性(92%一99%),与多粘类芽抱杆菌同源性为99%,最终鉴定其为多粘 类芽抱杆菌。 通过正交设计试验,优化了多粘类芽抱杆菌BS04发酵产拮抗物质的试验条 件。确定了BS04最佳发酵条件,培养基组成(g/L)为葡萄糖10,糊精7.5, 氯化钠5,玉米浆15,大豆粉30,碳酸钙3,自然pH,发酵接种量为30ml发 酵液接种1.5ml种子液(10日Cfu/ml含菌量),28oC培养2天(140r/min)。 以青枯假单胞菌为供试菌,采用改良的琼脂孔扩散法来进行生物跟踪,对 多粘类芽抱杆菌BSO4拮抗成分进行了分离纯化。在对发酵液处理上发现, 20一100%的(NH4)250;不能使拮抗成分沉淀,从而不能达到初步分离的目的:正己 烷、乙醚、乙酸乙醋三种有机溶剂均不能把拮抗成分从发酵液中萃取出来,说 明采用萃取法获得拮抗成分粗提液的方案也欠可行。用不同浓度的乙醇处理也 不能促使拮抗成分产生沉淀,但是通过上清液减压浓缩可获得拮抗成分浓缩液, 适合拮抗成分粗提液的制备。将发酵液经65%乙醇沉淀后,上清液减压浓缩经 过Sp一Sepharose Fast Flow柱层析和Souree SRPe反相柱层析后得到棕黄色的 纯化样品。将样品溶解在水中,测定其对青枯假单胞菌的拮抗作用,结果显示 BS04拮抗成分能耐受广泛的pH,并且热稳定性好,活性不受蛋白酶K和胰蛋白 酶影响,但是纯化的拮抗成分对病原真菌没有拮抗作用。拮抗成分的薄层层析 荀三酮显色阳性和红外光谱结果暗示此活性成分可能为肤类,质谱结果显示此 了 活性成分为4个分子量相近的混合物,其分子量分别为1143.7Da、1125.6Da、 1104.7Da和1085.7Da,但是是否这4个组分均有活性,还是只是其中一个或几 个有活性,以及活性组分的结构和抗菌谱还有待进一步研究。另外,拮抗组分 的200一40Onm扫描发现,其在209nm有一最高吸收峰,但是这并不代表每个组 分的最大吸收峰,这一指标对拮抗组分大批量分离纯化提供了监测手段。 通过对BSO4产酶能力的研究发现,BS04虽然没有几丁质酶活性,但是具 有纤维素酶和蛋白酶活性,这就说明其产生的纤维素酶和蛋白酶在抗真菌上发 挥了一定的作用,当然,这并不排除除降解纤维素和蛋白质以外的其他酶或未 知拮抗成分也在拮抗过程中发挥着作用。 通过显微观察,BS04代谢产物的拮抗成分可能是破坏了青枯假单胞菌的细 胞膜,致使胞内物外溢,菌体最后发生死亡。BSO4作用于真菌,使真菌发生菌 丝断裂解体,菌丝变形,内容物外溢。 关键词:植物病原菌;拮抗菌;筛选;鉴定; 多粘类芽袍杆菌;作用机理
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S476.1

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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10 马福荣;贾乐;任轩;杨凤苓;程成;;富钼酿酒酵母菌株的选育及其生物学功能研究[J];山东农业科学;2008年06期
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1 李锦龙;魏周玉;魏瑛;王健;陶树春;;唐菖蒲枯萎病田间消长规律及其防治技术的研究[A];中国球根花卉研究进展2011[C];2011年
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3 王健;魏瑛;陶树春;李锦龙;魏周玉;;仙客来主要病害种子处理技术和田间药剂防治试验[A];中国球根花卉研究进展2011[C];2011年
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7 马镝;;产壳聚糖酶菌株的筛选、鉴定及抑菌活性研究[A];科学发展与社会责任(A卷)——第五届沈阳科学学术年会文集[C];2008年
8 曹妍;杨钦滟;杜木英;阚健全;;山鸡椒油和八角精油抑菌作用的对比[A];管产学研助推食品安全重庆高峰论坛——2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛论文集[C];2011年
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10 陆曦诚;刘敬斌;陈国康;吴然然;;拮抗放线菌对蚕豆赤斑病的控病作用及机制探讨[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
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3 张俊忠;东祁连山高寒草地土壤真菌多样性研究[D];甘肃农业大学;2010年
4 郎亚军;Ectoines高效制备技术及其应用研究[D];大连海事大学;2010年
5 李永芹;养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立[D];中国海洋大学;2010年
6 赵祺;冻土细菌新种和冰缘植物内生细菌新种的特征和多相分类学研究[D];兰州大学;2010年
7 魏希颖;连翘种子挥发油化学成分、生物学活性及其自乳化药物传递系统的研究[D];陕西师范大学;2010年
8 张延妮;珠子参化学成分及其活性成分的筛选研究[D];陕西师范大学;2010年
9 朱兵峰;枯草杆菌两步法生产四甲基吡嗪的调控及机制的研究[D];江南大学;2010年
10 王大红;粘细菌Stigmatella WXNXJ-B产生新型抗肿瘤抗生素的研究[D];江南大学;2010年
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1 李光亮;水稻品种对白叶枯病菌致病小种的抗性鉴定及其小种间互作关系的研究[D];华中农业大学;2010年
2 汤珏婷;1,3-二氯丙烯在土壤环境中的行为及其对土传病原物的防控研究[D];华中农业大学;2010年
3 罗晶晶;斑点叉尾鮰生鱼片加工过程中的微生物变化[D];华中农业大学;2010年
4 郎晓磊;肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
5 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
6 张献芳;利用半夏凝集素构建内生工程菌及其抗同翅目害虫效果研究[D];华中农业大学;2010年
7 韩亚超;新型微生态制剂的研制[D];华中农业大学;2009年
8 田化平;海洋枯草芽胞杆菌DM03抗病原真菌物质的研究[D];华中农业大学;2009年
9 袁玮;贵州省苗族腌酸汤中产乳酸菌素菌的筛选与初步研究[D];华中农业大学;2010年
10 贺中华;黄鳝肠道菌群的初步分析和益生菌的开发与应用研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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6 杨泽敏,关故章,孙金才;我国生物农药的发展现状及对策[J];安徽农业科学;2004年03期
7 崔勤;李新丽;翟淑芝;;小麦叶片叶绿素含量测定的分光光度计法[J];安徽农业科学;2006年10期
8 裴韬;任大明;石皎;;小麦赤霉病拮抗菌P72抗菌物质的分离纯化和性质研究[J];安徽农业科学;2009年06期
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7 高向阳;新抗生素万隆霉素对黄瓜疫病菌的作用机理研究[D];华南理工大学;2005年
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6 孙伟红;长期秸秆还田改土培肥综合效应的研究[D];山东农业大学;2004年
7 孙海新;茶树根际促生细菌的研究[D];山东农业大学;2004年
8 田小卫;一株放线菌代谢产物的抗菌活性研究[D];西北农林科技大学;2004年
9 王艳;枯草芽孢杆菌B1、B2对几种植物病原真菌的抗菌机理及其抗菌物质的分离与鉴定[D];甘肃农业大学;2004年
10 贾洁;枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白的分离提取与应用[D];中国农业大学;2005年
【二级引证文献】
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2 张永升;张辉;陶佩君;张月辰;;河北省草莓产业可持续发展的SWOT分析[J];贵州农业科学;2012年07期
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7 何礼远;;青枯假单胞菌在中国的多样性(英文)[A];“植物病虫害生物学研究进展”——植物病虫害生物学国家重点实验室研究论文选[C];1995年
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9 毛国璋;何礼远;白小军;张长龄;;青枯假单胞菌野生型菌株的运动性研究[A];“植物病虫害生物学研究进展”——植物病虫害生物学国家重点实验室研究论文选[C];1995年
10 雷娟;蒋思远;杨志荣;;一株拮抗放线菌的分离及鉴定[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 镇江市蔬菜研究所 高小文;秋季湿度大番茄易发生青枯病[N];江苏农业科技报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 谢晶;植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理研究[D];四川大学;2004年
2 薛庆云;植物细菌性青枯病颉颃菌筛选策略研究及生防机理初探[D];南京农业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
1 赵昕梅;茄青枯假单胞菌花生寄主特异性毒性基因的功能鉴定[D];广西大学;2004年
2 廖薇;姜瘟病原菌的分离鉴定及其抑制物的筛选[D];四川大学;2004年
3 蔡恒;茄青枯假单胞菌寄主花生特异性毒性基因的功能分析[D];广西大学;2002年
4 冉红艳;青枯假单胞菌拮抗微生物的筛选、鉴定及发酵条件的研究[D];四川大学;2005年
5 周莉君;马桑抑菌物质的分离鉴定及抑菌机制研究[D];四川大学;2006年
6 陈晓梅;姜瘟病原菌拮抗放线菌SR-11菌株诱变选育及固体发酵可行性研究[D];四川大学;2007年
7 刘润叶;青枯劳尔氏菌拮抗细菌Q6的筛选、鉴定及发酵条件的研究[D];四川大学;2007年
8 李毅荣;水稻黄单胞菌水稻致病变种中国菌株13751hrcV基因的克隆、鉴定及其缺失突变体防治水稻白叶枯病的研究[D];广西大学;2001年
9 辛莹;卤代三苯醚类化合物的合成与抑菌活性研究[D];四川大学;2004年
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