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《四川大学》 2004年
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SARS冠状病毒S糖蛋白在HeLa细胞中表达的研究

苏丹  
【摘要】:目的:探索SARS冠状病毒(SARS-CoV)S糖蛋白在真核细胞内的表达定位及其相关功能。方法:分别构建融合有绿色荧光蛋白(GFP)基因或HA多肽抗原基因的SARS-CoV S糖蛋白全长cDNA质粒,测序得到本实验SARS-CoV样本S糖蛋白的基因序列图谱。利用生物信息学方法分析该样本S糖蛋白的基因序列,寻找到新的突变位点,绘制进化树。通过预测S糖蛋白的普通物理化学性质,为下一步实验提供相关信息和指导。利用非病毒性载体转染HeLa细胞,在激光共聚焦荧光扫描显微镜下,观察融合了GFP的SARS-CoV S糖蛋白(SGFP)的亚细胞定位;同时利用SARS患者康复血清和HA抗体进行蛋白印迹杂交,确定SARS-CoV S糖蛋白在真核细胞中的存在形式。结果:成功构建了重组质粒GFPS-PCS,SGFP-PCS,HAS-pCDNA,SHA-PCS,分别将GFP基因或HA多肽抗原基因融合到SARS-CoV S糖蛋白基因的N端和C端。通过生物信息学分析预测,SARS-CoV S糖蛋白基因具有高度的突变能力,其分子量大小为139KD,等电点(PI)为5.54,在哺乳动物细胞内表达稳定,并具有两个螺旋化螺旋结构(coiled-coil)。在荧光显微镜下发现,通过非病毒载体转染的SGFP融合蛋白的荧光弥散于整个HeLa细胞内,尤以细胞核区和胞浆区较为密集,而没有集中定位于细胞膜上。这种定位分布不随蛋白表达时间延长而发生显著变化。蛋白印迹杂交显示在70~90KD的区域有特异性条带。结论:利用非病毒性载体在HeLa细胞中表达的SGFP融合蛋白,主要分布于真核细胞核及胞浆内,少量定位于细胞膜上;SARS-CoV S糖蛋白在HeLa细胞中不是以完整形式存在,有被蛋白酶切割的可能性。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R373

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