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胆固醇氧化酶的菌种筛选、鉴定及酶的分离纯化与性质研究

许晓燕  
【摘要】:胆固醇氧化酶[COD,EC 1.1.3.6]是一类黄素蛋白,属于GMC氧化还原酶体系,它能催化胆固醇分解成4-胆甾烯-3-酮和过氧化氢,是胆固醇代谢过程中的一个关键酶。它以其特有的高特异性和高灵敏度现已被广泛地应用到血清胆固醇的临床诊断中。 由于不同菌种来源的胆固醇氧化酶的酶学性质和作用机理不同,同时不同菌种所需的营养与培养条件也不同,本论文对产胆固醇氧化酶菌种进行了筛选及鉴定;胆固醇氧化酶的发酵条件优化;胆固醇氧化酶的分离纯化及其基本性质四部分。主要研究结果如下: 1.对实验室现有菌株进行筛选,得到产胆固醇氧化酶较高的菌株B0503。经初步鉴定,该菌株为Brevibacterium sp.。 2.对筛选得到的Brevibacterium sp.进行底物诱导及发酵条件的优化,确定其最适培养基为(%):胆固醇0.2,蔗糖0.3,酵母膏0.2,蛋白胨0.3,牛肉膏0.3,K_2HPO_4 0.1,MgSO_4 0.05,pH6.8。最适培养条件为:种龄18h,接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL培养基/250mL三角瓶,200r/min。在最适培养基及最适条件下,胆固醇氧化酶的酶活力可达到2439U/L,比未优化前195U/L提高了12倍。 3.Brevibacterium sp.经胆固醇诱导培养,培养上清液依次经过中空纤维柱、80%(NH_4)_2SO_4沉淀、CM-Sepharose FF离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析纯化了胆固醇氧化酶,酶比活力达38.904U/mg,纯化倍数为14.9倍,回收率为38.2%.。纯化的酶经还原、非还原SDS-PAGE分析为单一蛋白染色带。


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