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囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)凝集素Ⅱ基因在大肠杆菌中克隆表达、重组蛋白纯化及性质研究

安洁  
【摘要】:将编码黄精凝集素(Polygonatum cyrtonema Hua.lectin Ⅱ,简称PCLⅡ)成熟肽的DNA片段(P)定向克隆到pET32a(+)表达质粒载体中后,获得重组质粒pET-P。用该重组质粒转化E.coli.BL21(DE3)菌株,所获得的阳性转化子经菌落Western检测表达产物。在用IPTG诱导后,插入片段得到表达,用SDS-PAGE检测发现表达产物的分子量约为29kD。优化诱导表达条件,使所表达的融合蛋白大部分位于E.coli.破菌上清液中。取大肠杆菌破菌上清液,利用所表达的融合蛋白N末端6个组氨酸的标签,用金属亲和层析柱进行纯化。纯化的融合蛋白再经肠激酶酶切作用后,再用金属亲和层析柱、离子交换层析柱等进行纯化。经Western印迹分析,证实得到的纯化重组蛋白(recombinant PCLⅡ,简称rPCLⅡ)可与RGS-His抗体和天然PCLⅡ(natural PCLⅡ,简称nPCLⅡ)抗兔血清发生专一性抗原抗体反应,提示重组蛋白与天然PCLⅡ的特征一致,从而进一步证实所克隆到的基因为编码PCLⅡ的基因。rPCLⅡ能凝集兔血细胞,效价为1.95μg/mL;对外周血淋巴细胞具有很强的促有丝分裂能力;对酸碱、温度比较稳定;在抗病毒活性方面,rPCLⅡ能有效地降低Ⅱ型人类单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的感染,在1058μ g/mL时对正常Vero细胞无细胞毒性,IC_(50)=1.52μg/mL,TC/IC为3565.8,表明rPCLⅡ是一种有效的抗病毒蛋白。rPCLⅡ与nPCLⅡ相比,生物活性略有下降。


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