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《四川大学》 2006年
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新型融合抗菌肽基因的构建及表达活性研究

程驰  
【摘要】:为探索构建广谱高效的抗感染新型制剂,本实验应用重叠区PCR(overlap extension PCR)技术构建了ESC、citropin1.1和DHV4三种抗菌肽(分别略写为ESC、CIT1和DHV4)的融合基因(命名为ECD)。为了保证结构域不相互干扰,在融合基因中加入了由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性连接肽序列(Gly+Gly+Gly+Ser+Gly+Gly+Ser和Gly+Gly+Ser+Gly+Gly+Ser+Gl),并用软件ANTHEPROT 5.0对其序列和结构进行调整。考虑到原核表达时大肠杆菌对密码子的偏好性,本实验对融合肽基因序列作了同义突变,设计并合成了四条70bp左右的片段,采用重叠区PCR法,利用高保真Pfu DNA聚合酶扩增出融合肽基因。 构建了pGEX-4T-1-ECD(略为pG-ECD)原核表达载体并作BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切、质粒PCR和测序验证。将正确构建的融合蛋白表达载体转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),用2×YTA培养基培养,以IPTG诱导表达,作SDS—PAGE分析表达情况。结果表明,该GST-融合蛋白分子量为33kD,与预测的大小相符;该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中、0.5mmol/LIPTG和28℃诱导温度下表达效果最好,但表达量与pGEX-4T-1空对照相比相对较少;其表达量在4h内与诱导时间成正相关;同时该融合蛋白主要以可溶形式存在。为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。 融合基因表达培养液经破碎裂解得到融合蛋白上清粗制品,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱吸附,PBS缓冲液温育洗脱后,在96孔板上初步检测该融合蛋白对四种标准菌株——大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26112、肺炎链球菌(Streptococcus penumoniae)ATCC49619和绿脓杆菌(Pseudomonas
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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