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《四川大学》 2007年
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食品中常见病原菌快速检测系统研究

沈圣  
【摘要】: 目的 为建立以磁分离技术为核心的分离系统,摸索制备具有非特异吸附性能的裸磁珠及其包被的条件,为下一阶段免疫磁珠的制备奠定基础。同时建立以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的TaqMan实时荧光PCR快速检测方法,并对该方法进行了初步的优化、评价及应用。 方法 本研究分为两部分内容: 1裸磁珠的制备及包被 1.1磁珠的制备 Fe~(2+)和Fe~(3+)分别与OH离子反应生成Fe(OH)_2和Fe(OH)_3,Fe(OH)_2和Fe(OH)_3不稳定,分别降解生成FeO和Fe_2O_3,即最后生成了Fe_3O_4。用蒸馏水洗涤磁珠至中性,并用磁分离架进行分离。 1.2磁珠的包被 以1%的醋酸溶解壳聚糖,将壳聚糖包被于制备好的裸磁珠表面后,进而再包被上作为交联剂的戊二醛。 2 TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌方法的建立 通过比较大量芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的特异性基因,最终选择ITS基因作为检测的目的片段。从GenBank中下载ITS基因序列并进行同源性比较,选择保守区段进行引物和探针的设计。对比CTAB法和硅胶模型基因组DNA提取法两种DNA提取方法,选取实时荧光PCR快速检测方法建立初期,合适的DNA标准制备方法。同时,通过优化引物浓度、退火温度、探针浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及缓冲液浓度,以建立起TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的方法。最后,检验该方法的灵敏度和特异性,并对模拟样品进行了检测。 结果 1磁珠的制备和包被 成功制备出裸磁珠,经透射电镜观察,裸磁珠直径达到纳米级,制备的磁珠在溶液中悬浮性较好,在磁场的作用下可较好的分离该磁性微粒。壳聚糖溶解于1%醋酸后用于包被制备的磁珠,包被磁珠体积增大,可用于连接抗体,为后续免疫磁珠的制备奠定了基础。 2选取16S-23S rDNA基因间区序列作为目的基因设计引物和探针如下:上游引物:5′-GAGTCCATTTAGGCCCACCATAC-3′下游引物:5′-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3′TaqMan探针:5′-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3′ 经过优化,成功建立了以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR的快速检测方法,优化后的反应体系如下表所示。并通过比较,最终选取硅胶模型基因组DNA提取法,成功制备了该检测方法的DNA初标准。同时该方法的评测结果显示,该方法的检测灵敏度达到172fg,菌液灵敏度达到22cfu/反应体系;且该方法特异性较好,可同时检测包括蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌在内的4种芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌。 结论 本研究为建立常见食源性病原菌快速检测系统,在分离手段上成功制备了纳米级的裸磁珠和包被磁珠,为下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基础。同时,成功建立了芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR快速检测方法,为芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌引起的食物中毒检测提供了又一灵敏、特异的方法。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R155.5

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【参考文献】
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