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《四川大学》 2007年
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泛素—蛋白酶体系在上皮性卵巢癌的差异性表达研究及阻断泛素—蛋白酶体途径促凋亡作用机制的初步分析

杨瑛  
【摘要】: 目的:本课题通过采用限制片段差异显示聚合酶链反应(RestrictionFragment Differential Display-Polymerase Chained Reaction,RFDD-PCR)技术建立卵巢癌组织与正常卵巢组织基因差异表达谱,初步分析比较与卵巢癌发病机制相关基因的表达差异,探讨卵巢癌与泛素—蛋白酶体系统的关系,有助于阐明卵巢癌的发病机制,寻找与临床诊断、治疗有关的生物学标记或治疗靶点;研究蛋白酶体抑制剂MG132对人卵巢癌SKOV3细胞生长和凋亡的影响,旨在探讨其促凋亡作用机制。 方法:采集上皮性卵巢癌手术患者的卵巢癌组织和正常卵巢组织,用RFDD-PCR技术平行操作,建立卵巢癌组织与正常卵巢组织基因差异表达谱,对各组织间有表达差异的基因进行生物信息学分析,筛选与卵巢癌发病机制相关的基因,观察泛素.蛋白酶体系统重要组成部分基因表达差异,并用半定量RT-PCR方法和免疫组织化学法对差异表达行进一步验证;用MTT法测定MG132对卵巢SKOV3细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组细胞凋亡率和细胞周期的变化;采用TUNEL法观察细胞凋亡形态学变化;半定量RT-PCR技术、免疫细胞化学方法检测干预后细胞中泛素-蛋白酶体相关基因、p53、bcl-2、caspase-3的mRNA和蛋白水平变化。结果:1.运用RFDD—PCR技术,我们构建了两种不同组织的基因表达谱,共获得了有意义的电泳条带5642条,其中卵巢癌组织2227条,正常卵巢组织3384条,其中癌组织和正常组织问有表达差异的片段为2082个,占表达数的36.9%。通过对卵巢癌组织差异表达谱的分析中发现与肿瘤的发生、发展密切相关的原癌基因和抑癌基因、细胞周期相关基因、增殖和凋亡相关基因、血管生长因子、代谢酶等6类基因36种因子的表达差异,其中在泛素-蛋白酶体系统中PSMB5、PSMD2、PSMD8、USP9X、USP9Y、USP2、USP14和UBE4A在卵巢癌组织中高表达,而在正常卵巢组织中无表达或低表达;PSMA7、PSMB2、PSMB9、PSMD1、PSMD11、USP4、USP5、USP7,USP8、USP11、USP16、USP21、USP25、USP26和UBE2B在正常卵巢组织中高表达,而在卵巢癌组织中无表达或低表达;PSMA1在两种组织中表达无差异;原癌基因ras,c-myc在卵巢癌组织中高表达,在正常组织中无表达;抑癌基因p53、PTEN、BRCA1在正常卵巢组织中高表达,而在卵巢癌组织中无表达或低表达;在细胞周期相关因子中,P27在正常卵巢组织中高表达,而CDK4、CDK6、CDK8在卵巢癌组织中高表达;凋亡相关基因bcl-2在卵巢癌组织中高表达;血管生长因子VEGF、EGF、FGF在卵巢癌组织中高表达,而在正常卵巢组织中无表达或低表达。2.运用半定量RT-PCR方法和免疫组织化学法证实泛素-蛋白酶体系统中部分基因在卵巢癌组织中表达上调。3.MTT法结果显示:蛋白酶体抑制剂MG132可抑制SKOV3细胞生长,并呈明显的浓度-时间依赖方式。4.流式细胞术结果显示:蛋白酶体抑制剂MG132能明显诱导SKOV3细胞凋亡,在5、10μmol/L MG132作用于SKOV3细胞24小时后,凋亡率分别为42.8%和61.7%,均明显高于对照组(4.5%),差别有统计学意义(P<0.05);并使细胞周期阻止于G_1期,呈浓度依赖方式。5.TUNEL法显示MG132处理后的SKOV3细胞中出现凋亡小体,在2.5μmol/L、5μmol/L浓度MG132作用下细胞凋亡率与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05),且两组间比较亦有显著性差异(P<0.05),有统计学意义(P<0.05)。6.免疫细胞化学和半定量RT-PCR结果显示:泛素-蛋白酶体系统中部分基因在人卵巢癌SKOV3细胞表达,MG132作用于SKOV3细胞24小时后泛素-蛋白酶体系统中部分基因、bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下调,而p53、caspase-3的mRNA和蛋白表达水平上调。结论:利用RFDD-PCR差异显示技术能够建立卵巢癌组织和正常卵巢组织基因差异表达谱,是对肿瘤的发病机制和寻找治疗靶点研究的一种有效的手段。通过对卵巢癌组织差异表达谱的分析中发现与肿瘤的发生、发展密切相关的原癌基因和抑癌基因、细胞周期相关基因、增殖和凋亡相关基因、血管生长因子、代谢酶等6类基因36种因子的表达差异,其中发现卵巢癌组织中泛素-蛋白酶体系统组成部分在基因水平表达上调,免疫组化和半定量RT-PCR法也证实在卵巢癌组织表达上调,结果提示卵巢癌中泛素-蛋白酶体系统活动明显增强,卵巢癌的发生发展可能与泛素-蛋白酶体系统功能改变有关,为今后卵巢肿瘤的发病机制和治疗的研究提供了线索。2.蛋白酶体抑制剂MG132具有抑制人卵巢癌SKOV3细胞生长和诱导凋亡作用,使细胞周期阻滞于G_1期。3.蛋白酶体抑制剂MG132诱导细胞凋亡的机制可能与MG132下调泛素一蛋白酶体系统相关基因表达,促进p53,caspase3基因转录并减少蛋白降解,降低bcl-2基因转录并增加蛋白降解,使细胞内p53,caspase3蛋白增加,bcl-2蛋白减少而促使细胞凋亡有关。 研究结果显示利用RFDD-PCR差异显示技术建立卵巢癌组织和正常卵巢组织基因差异表达谱,能够大规模初步筛选与卵巢癌发病机制相关基因,为进一步研究提供线索;泛素-蛋白酶体系统与卵巢癌的发生发展有关;经MG132干预后减少泛素-蛋白酶体系统组成部分相关基因的表达、抑制SKOV3细胞生长,表明泛素-蛋白酶体系统可能是卵巢癌基因治疗的新靶点;从MG132抑制泛素-蛋白酶体系统组成部分相关基因与上调p53,caspase3,下调bcl-2表达水平有关提示诱导细胞凋亡可能是其作用机制。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.31

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