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《四川大学》 2007年
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靶向抗肿瘤偶联物苯丙胺酸氮芥—已二酸桥—偕二磷酸的靶向性及疗效实验研究

李伟  
【摘要】: 目的:靶向抗肿瘤药物在肿瘤局部靶向部位高浓度聚集,特异性识别、杀灭恶性骨肿瘤细胞,全身其它非靶向脏器药物浓度低,毒副作用小,达到高效低毒治疗骨肿瘤的目的。本研究的目的在于开发一种新型的靶向抗肿瘤药物,将亲骨性载体二膦酸盐与化疗药物苯丙胺酸氮芥偶联,并将放射性核素~(153)Sm与偶连物鳌合,合成一种双膦酸盐和亲骨核素为导向、化疗药物和β射线协同发挥作用的骨肿瘤靶向治疗系统,并通过体内体外实验验证合成偶联物的效应,为以后的临床试验用药提供理论依据。 方法:(1)偶连物的合成及鉴定:将苯丙胺酸氮芥与二膦酸盐耦联,~(153)Sm与偶联物鳌合,合成新的偶联物,采用核磁共振仪、红外光谱仪、质谱分析进行偶合物的元素分析、红外光谱分析、~1H-NMR谱图分析,确定其组分、相对含量及结构鉴定;羟基磷灰石晶体吸附实验和荷瘤鼠体内分布显像实验,初步了解偶联物体内外的亲骨性能。(2)偶联物的细胞毒性实验:①体外培养观察不同浓度的偶连物对人成骨细胞的影响;②采用MTT、细胞活力分析、丫啶橙染色、流式细胞术、扫描电镜,观察不同浓度的偶连物对MG-63细胞增殖和凋亡的影响,研究偶联物对其生物学行为的影响。(3)裸鼠体内偶连物抗肿瘤实验研究:①用γ免疫计数仪、高效液相色谱仪分析测定靶组织(骨、肿瘤)和非靶组织(心、肝、肾)药物浓度,研究偶联物在小鼠体内的动力学分布规律和骨靶向性;②不同浓度偶连物对肿瘤的影响,计算抑瘤率;③RT-PCR和Western blot法,检测实验组和对照组caspase-3基因、C-myc基因表达差异。 结果:(1)偶连物的合成及鉴定:对合成的偶联物结构进行核磁共振波谱分析,得出的光谱数据符合药物合成的要求;偶联物在体外对羟基磷灰石具有良好的吸附性能,在体内骨骼系统和血流丰富的脏器,尤其是肿瘤部位高度浓聚。(2)偶联物的细胞毒性实验:①不同浓度的偶联物对成骨细胞的贴壁率、体外克隆形成及细胞活力无明显影响,MTT实验显示偶联物各浓度组的成骨细胞OD值逐日增高,各组之间无统计学差异(P>0.05)。②MG-63骨肉瘤细胞MTT实验显示:不同浓度的偶联物及苯丙胺酸氮芥作用下的骨肉瘤细胞,经过24到96小时培养后,OD值均减小,其中2000ug/ml浓度的偶联物组及阳性对照组在同一时间有显著性差异(P<0.05)。细胞活力分析显示活细胞比例明显降低。各时间点各浓度组细胞活力无统计学差异(P>0.05);24小时,400ug/ml、2000ug/ml组与阳性对照组间有显著性差异(P<0.05);48小时,4ug/ml、400ug/ml、2000ug/ml组与阳性对照组间有显著性差异(P<0.05)。丫啶橙染色结果:随着药物浓度提高和作用时间延长,可见凋亡小体形成。流式细胞仪检测发现:偶联物浓度为40ug/ml,苯丙胺酸氮芥浓度20ug/ml作用过的MG—63骨肉瘤细胞从24到96小时,凋亡率逐渐增高。电镜观察结果:对照组可见骨肉瘤细胞核完整规则,实验组随作用药物浓度及作用时间增加,出现典型的凋亡细胞。(3)裸鼠体内偶连物抗肿瘤实验研究:①小鼠体内放射性计数分布显示骨组织中的强度远远高于其它脏器,在3小时左右药物在骨组织中的浓度达到峰值。荷瘤裸鼠各个脏器中放射性计数在肿瘤组织中最高,其次为骨组织,再次为性腺、脾、肺等脏器。②经偶联物及苯丙胺酸氮芥作用后,裸鼠肿瘤生长明显受抑制,实验组高中剂量组与对照组间瘤重有统计学差异(P<0.05),两组对照组间肿瘤重量未见统计学差异(P>0.05)。实验组与阳性对照组的抑瘤率分别是37.85%、32.02%、16.16%和17.11%。高、中剂量组肿瘤抑制率均大于30%。大体观察发现偶联物处理组的裸鼠饮食及精神等状况均优于苯丙胺酸氮芥处理组;组织病理学观察见偶联物及苯丙胺酸氮芥处理的瘤体标本肿瘤,部分出现变性坏死,而未经药物处理的瘤体肿瘤细胞生长活跃。③偶连物组肿瘤组织中Caspase-3的表达明显高于对照组(P<0.05):用药组C-myc癌基因的mRNA较对照组下降了3.26倍。 结论: 1.新合成的偶联物符合原药的功能结构特征;羟基磷灰石体外吸附试验、核素~(153)Sm标记偶联物荷瘤鼠体内分布显像实验确定该偶联物具有骨靶向性,并且偶连物对骨肿瘤区域有较好的靶向性。 2.偶联物对人成骨细胞的毒性作用轻微;偶联物对骨肉瘤MG-63细胞有较强的诱导凋亡作用,随着偶联物浓度的升高及作用时间的延长MG-63细胞的凋亡率逐渐上升。 3.体内分布说明偶联物有高度的骨靶向性。同苯丙胺酸氮芥比较,高、中剂量偶联物均可明显抑制裸鼠骨肉瘤的生长,病理学组织检查发现偶联物对肝肾无明显的损害。 4.新合成的偶联物作为抗骨肿瘤药物的一种新尝试,为抗肿瘤药物的合成和临床治疗提供了一种新思路,为肿瘤的治疗和疗效评估开辟了新领域,具有潜在的临床应用价值。
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