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《四川大学》 2007年
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自噬基因Beclin 1与宫颈癌相关性的实验研究

王赞宏  
【摘要】:背景与研究目的 宫颈癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤,全世界每年有50多万人患病,其中80%在发展中国家,严重威胁妇女的健康和生命。尽管宫颈癌的治疗取得了巨大进展,但晚期患者5年生存率仅为50%左右。生物治疗已成为目前肿瘤治疗的研究热点,但多以凋亡诱导为主,将自噬性细胞死亡引入肿瘤治疗,可能成为新的治疗靶点。 程序性细胞死亡可以分为凋亡和自噬两种方式,自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡,具有特殊的形态学改变和独有的调控通路,与凋亡截然不同。自噬是正常细胞的功能,是真核细胞蛋白降解的重要途径,是维持细胞自我平衡的重要机制,自噬异常与肿瘤形成有关。近来,随着人类自噬基因Beclin 1的克隆成功,进一步了解自噬在人类肿瘤中的作用,探索自噬调控通路,明晰自噬与凋亡的相互关系,成为目前的研究热点。 Beclin 1是新近克隆的哺乳动物的自噬调控基因,位于染色体17q21,在75%的卵巢癌,50%的乳腺癌和40%的前列腺癌中表现为单等位基因缺失,是候选的肿瘤抑制基因。关于Beclin 1与宫颈癌的相关性研究,目前尚未见到报道。本课题旨在研究自噬基因Beclin 1在宫颈癌组织中的表达,Beclin 1基因表达质粒及特异性RNA干扰质粒分别在体内、体外对宫颈癌HeLa细胞生长、凋亡、自噬的影响,探索自噬诱导在宫颈癌治疗中的可行性,为宫颈癌的基因治疗提供新的靶点。 方法通过免疫组化SP法检测Beclin 1蛋白在宫颈癌组织中的表达;通过目的基因克隆、载体构建,RNA干扰技术,构建Beclin 1基因表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1,分别观察它们在体内、外对宫颈癌HeLa细胞生长、自噬和凋亡的影响: 1.采用免疫组化SP法检测Beclin 1基因在宫颈癌组织(n=81)、CIN组织(n=20)、正常宫颈组织(n=20)中的表达状况,分析Beclin 1与宫颈癌临床分期、病理分级、淋巴结转移等临床病理因素的相关性; 2.通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得Beclin 1基因,构建Beclin 1基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1;采用计算机软件设计针对Beclin 1的特异性RNA干扰序列,构建Beclin 1基因的小发夹状RNA(shRNA)真核表达质粒pSUPER—Beclin 1; 3.利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和pSUPER—Beclin 1转染HeLa细胞,筛选稳定表达株,以荧光定量RT-PCR检测转染前后Beclin 1及caspase-9 mRNA的变化,以western blot检测转染前后Beclin 1及caspase-9蛋白的变化;采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡、自噬的变化;电镜检测自噬泡的形成,MDC染色检测自噬体的数量;MTT法检测细胞的增殖变化; 4.将上述两株稳定表达株分别接种到裸鼠皮下成瘤,建立雌性裸鼠异体移植宫颈癌模型,观察瘤体生长速度及瘤体大小,免疫组化检测瘤体组织中Beclin 1蛋白的表达。 采用,检验和x~2检验进行统计学分析。 结果 1.宫颈癌组织中Beclin 1的蛋白表达阳性率低于正常宫颈和CIN组织(P<0.05),宫颈癌中常见Beclin 1表达下调和缺失;正常宫颈与CIN间Beclin 1的表达无显著性差异(P>0.05); 2.Beclin 1表达与宫颈癌的临床分期、病理类型、宫颈浸润深度、宫颈肿瘤大小、肿瘤大体类型均无相关性(P>0.05);在高中分化组中Beclin 1的蛋白表达率高于低分化组,在有淋巴结转移组表达率低于无淋巴结转组(P<0.05);新辅助化疗前后Beclin 1蛋白的表达无显著性差异(P>0.05): 3.利用PCR分析,酶切鉴定及DNA测序证实Beclin 1基因的表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1构建成功; 4.Beclin 1基因表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1转染HeLa细胞后,Beclin 1、caspase-9 mRNA和蛋白的表达显著提高(P<0.05),与未转染组相比,G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显降低,凋亡细胞和自噬细胞明显增加,并促进了自噬泡的形成,细胞生长活性降低; 5.Beclin 1基因的RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1转染HeLa细胞后,Beclin 1、caspase-9 mRNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05),与未转染组相比,G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增高,凋亡细胞和自噬细胞明显减少,自噬泡形成减少,细胞生长活性增强; 6.表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1使HeLa细胞裸鼠体内Beclin 1蛋白表达增加,成瘤时间延长,细胞生长减慢,瘤体体积及重量明显变小,抑瘤率为52.15%;RNA干扰质粒pSUPER-Beclin 1则抑制Beclinl蛋白表达,缩短成瘤时间,肿瘤体积和重量增大达40.32%。 结论自噬基因Beclin 1与宫颈癌的发生、发展有关,自噬基因Beclin 1可有效调控肿瘤细胞周期,抑制宫颈癌细胞的恶性增殖,提高肿瘤细胞的自噬和凋亡能力,部分逆转其恶性表型,同时提高细胞的自噬和凋亡能力可能成为宫颈癌基因治疗的新靶点。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.33

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【引证文献】
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【参考文献】
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