麻疯树毒蛋白curcin的表达、纯化、复性及体外活性和几丁质酶性质的研究

【摘要】： 麻疯树(Jatropha Cgrcas L)是大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)的植物，是一种多用途的油料植物。Stripe(1976)首次从麻疯树种子中分离出的麻疯树毒蛋白，后来的研究又进一步证实了麻疯树种子含毒成分主要是种子毒蛋白(curcin)，该蛋白是一种单链核糖体失活蛋白(RIP)。核糖体失活蛋白是一类作用于rRNA而抑制核糖体功能的毒蛋白，广泛存在于高等植物中。核糖体失活蛋白能抑制肿瘤细胞和艾滋病毒的生长，因此把RIP的A链与特定的癌细胞衍生的单克隆抗体连接制备的导向药物(免疫毒素)能高效率地杀伤癌细胞，将成为抗癌药物研究的重要方向，从而使RIP有着广阔的应用前景。本实验室已对麻疯树毒蛋白的活性进行了深入而细致的研究，研究表明从麻疯树种子中提取的毒蛋白能在体外抑制多种肿瘤细胞的生长，能明显抑制无细胞系蛋白质的翻译，且对正常细胞的生长没有明显的抑制作用，由此可以说明麻疯树是一种具有较大开发前景的植物。但由于麻疯树生长周期长及可供利用的麻疯树资源是有限的，不适合大量开发利用，因此为了使其更好地服务于人类使其有效成分便于生产及更好地保护和利用麻疯树，作者在前人研究的基础上，将编码curcin的基因进行体外克隆、表达和纯化，并将表达的重组蛋白进行纯化复性，进一步检测其体外活性，为进一步研究利用麻疯树curcin提供理论基础。 研究表明，可以用PCR方法从麻疯树种子RNA中克隆出编码麻疯树成熟蛋白的基因片段，且经菌落PCR和质粒双酶切检测表明该片段可以导入载体pQE-30和pET-32中；但SDS-PAGE、菌落Western和Western-blot检测发现，仅有载体pQE-30能成功地表达出curcin的重组蛋白，说明载体pET-32不适合该蛋白的表达。同时对所表达的蛋白进行可溶性分析发现，该重组蛋白主要以包涵体的形式存在。 选用不同的诱导剂、不同诱导温度、不同Amp浓度及不同加入诱导剂的时间等条件，诱导重组菌中重组蛋白的表达。结果表明：IPTG能诱导重组curcin的表达，而木糖和半乳糖则不能诱导其表达；在相对较低温度时不能诱导目标蛋白的表达，而当温度逐渐升高时目标蛋白质的量也不断增加，当温度达到28℃时，在相同条件下，目标蛋白质的表达量达到最大，且其表达量不再随温度的升高而增加；当温度高于37℃时，其表达量有降低的趋势。进一步的研究发现在Amp浓度为200mg／L时重组菌表达的目的蛋白质的量最大；且在相同条件下，更换培养基后再加入诱导剂可使目标蛋白的表达量高于不换培养基的处理。 研究发现所得的重组蛋白为包涵体，因此用超声破碎、离心等方法将包涵体分离出来，并用不同的变性剂种类及浓度将所得的包涵体溶解，用Ni-NTA亲和柱将重组蛋白纯化，并通过透析将纯化后的蛋白进行复性，通过低温干燥复性后的重组蛋白。用兔网织红细胞裂解液无细胞翻译系统对重组蛋白的活性进行测定；在体外用小细胞肺癌细胞NCL—H446、小鼠肉瘤腹水型细胞S-180、胃癌细胞SGC7901、疱疹性口炎病毒VSV、WISH细胞等测定其抑制肿瘤细胞增殖的能力；同时将用重组蛋白处理过的肿瘤细胞S180进行荧光染色，在显微镜下观察细胞凋亡的情况。结果表明：重组蛋白能较好地溶于6M尿素，且可以通过Ni-NTA亲和柱层析后可以得到大小约为30kD的电泳纯重组蛋白，为该蛋白的纯化奠定了理论基础。研究表明该重组蛋白能抑制无细胞系蛋白质的合成；体外活性测定表明，该蛋白能抑制肿瘤细胞S180、NCL-H446、SGC7901细胞的增殖，但是对病毒无抑制活性；细胞凋亡实验发现，该重组蛋白能诱导S180细胞的凋亡，且有一定的剂量关系，表明该蛋白具有开发成抗肿瘤药物的前景。 几丁质酶(EC3.2.1.14)是主要降解连接N-乙酰葡萄糖高分子聚合物(主要是几丁质)的β-1，4糖苷键的一种水解酶。几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中，在整个生物界中，植物几丁质酶是研究得较多且较为详细的几丁质酶，因为它在植物抗病过程中起到了重要作用，因此受到了广大科研工作者的重视。研究发现，植物几丁质酶不仅参与植物的抗病过程，还参与植物的生长发育等过程，由此可知几丁质酶在植物的生长、发育中起着极其重要的作用。麻疯树种子中含丰富的蛋白质资源。到目前为止，已从麻疯树种子中分离出具有抗癌活性的蛋白，酯酶、脂肪酸酶和葡聚糖酶等，并对其性质进行了测定和研究，然而在麻疯树病程相关蛋白的研究中，有关麻疯树几丁质酶的分离纯化及相关研究却未见报道。为了进一步探讨麻疯树防卫反应的物质基础，特别是麻疯树抗植物病原真菌的物质基础，我们对麻疯树几丁质酶的基本性质进行了研究。用不同pH值(pH4～9)的提取缓冲液分别提取麻疯树种子中的几丁质酶，检测并比较其酶活性，从而优化麻疯树几丁质酶的提取条件。将在最适pH的缓冲液中提取所得的几丁质酶粗提液与反应底物(胶体几丁质)在不同反应温度(30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃)、不同反应时间(10min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min)下进行反应以测定其酶活性。结果表明，在麻疯树种子中有几丁质酶的存在，并且在提取缓冲液pH为7.0时，所得的几丁质酶粗提液活性最高；通过对麻疯树几丁质酶作用的时间、作用温度等条件的分析发现：麻疯树几丁质酶粗提液在温度为55℃时，与底物胶体几丁质作用60min后，可最大效率地降解几丁质。同时，本实验还比较了麻疯树不同组织中几丁质酶的比活性，结果表明：从麻疯树幼苗的根、茎、叶中都发现有几丁质酶活性的物质的存在。但比活性大小存在差异，具体表现在：叶＞茎＞根。为进一步研究利用麻疯树资源奠定了基础。