收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

麻疯树毒蛋白curcin的表达、纯化、复性及体外活性和几丁质酶性质的研究

罗孟军  
【摘要】: 麻疯树(Jatropha Cgrcas L)是大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)的植物,是一种多用途的油料植物。Stripe(1976)首次从麻疯树种子中分离出的麻疯树毒蛋白,后来的研究又进一步证实了麻疯树种子含毒成分主要是种子毒蛋白(curcin),该蛋白是一种单链核糖体失活蛋白(RIP)。核糖体失活蛋白是一类作用于rRNA而抑制核糖体功能的毒蛋白,广泛存在于高等植物中。核糖体失活蛋白能抑制肿瘤细胞和艾滋病毒的生长,因此把RIP的A链与特定的癌细胞衍生的单克隆抗体连接制备的导向药物(免疫毒素)能高效率地杀伤癌细胞,将成为抗癌药物研究的重要方向,从而使RIP有着广阔的应用前景。本实验室已对麻疯树毒蛋白的活性进行了深入而细致的研究,研究表明从麻疯树种子中提取的毒蛋白能在体外抑制多种肿瘤细胞的生长,能明显抑制无细胞系蛋白质的翻译,且对正常细胞的生长没有明显的抑制作用,由此可以说明麻疯树是一种具有较大开发前景的植物。但由于麻疯树生长周期长及可供利用的麻疯树资源是有限的,不适合大量开发利用,因此为了使其更好地服务于人类使其有效成分便于生产及更好地保护和利用麻疯树,作者在前人研究的基础上,将编码curcin的基因进行体外克隆、表达和纯化,并将表达的重组蛋白进行纯化复性,进一步检测其体外活性,为进一步研究利用麻疯树curcin提供理论基础。 研究表明,可以用PCR方法从麻疯树种子RNA中克隆出编码麻疯树成熟蛋白的基因片段,且经菌落PCR和质粒双酶切检测表明该片段可以导入载体pQE-30和pET-32中;但SDS-PAGE、菌落Western和Western-blot检测发现,仅有载体pQE-30能成功地表达出curcin的重组蛋白,说明载体pET-32不适合该蛋白的表达。同时对所表达的蛋白进行可溶性分析发现,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在。 选用不同的诱导剂、不同诱导温度、不同Amp浓度及不同加入诱导剂的时间等条件,诱导重组菌中重组蛋白的表达。结果表明:IPTG能诱导重组curcin的表达,而木糖和半乳糖则不能诱导其表达;在相对较低温度时不能诱导目标蛋白的表达,而当温度逐渐升高时目标蛋白质的量也不断增加,当温度达到28℃时,在相同条件下,目标蛋白质的表达量达到最大,且其表达量不再随温度的升高而增加;当温度高于37℃时,其表达量有降低的趋势。进一步的研究发现在Amp浓度为200mg/L时重组菌表达的目的蛋白质的量最大;且在相同条件下,更换培养基后再加入诱导剂可使目标蛋白的表达量高于不换培养基的处理。 研究发现所得的重组蛋白为包涵体,因此用超声破碎、离心等方法将包涵体分离出来,并用不同的变性剂种类及浓度将所得的包涵体溶解,用Ni-NTA亲和柱将重组蛋白纯化,并通过透析将纯化后的蛋白进行复性,通过低温干燥复性后的重组蛋白。用兔网织红细胞裂解液无细胞翻译系统对重组蛋白的活性进行测定;在体外用小细胞肺癌细胞NCL—H446、小鼠肉瘤腹水型细胞S-180、胃癌细胞SGC7901、疱疹性口炎病毒VSV、WISH细胞等测定其抑制肿瘤细胞增殖的能力;同时将用重组蛋白处理过的肿瘤细胞S180进行荧光染色,在显微镜下观察细胞凋亡的情况。结果表明:重组蛋白能较好地溶于6M尿素,且可以通过Ni-NTA亲和柱层析后可以得到大小约为30kD的电泳纯重组蛋白,为该蛋白的纯化奠定了理论基础。研究表明该重组蛋白能抑制无细胞系蛋白质的合成;体外活性测定表明,该蛋白能抑制肿瘤细胞S180、NCL-H446、SGC7901细胞的增殖,但是对病毒无抑制活性;细胞凋亡实验发现,该重组蛋白能诱导S180细胞的凋亡,且有一定的剂量关系,表明该蛋白具有开发成抗肿瘤药物的前景。 几丁质酶(EC3.2.1.14)是主要降解连接N-乙酰葡萄糖高分子聚合物(主要是几丁质)的β-1,4糖苷键的一种水解酶。几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中,在整个生物界中,植物几丁质酶是研究得较多且较为详细的几丁质酶,因为它在植物抗病过程中起到了重要作用,因此受到了广大科研工作者的重视。研究发现,植物几丁质酶不仅参与植物的抗病过程,还参与植物的生长发育等过程,由此可知几丁质酶在植物的生长、发育中起着极其重要的作用。麻疯树种子中含丰富的蛋白质资源。到目前为止,已从麻疯树种子中分离出具有抗癌活性的蛋白,酯酶、脂肪酸酶和葡聚糖酶等,并对其性质进行了测定和研究,然而在麻疯树病程相关蛋白的研究中,有关麻疯树几丁质酶的分离纯化及相关研究却未见报道。为了进一步探讨麻疯树防卫反应的物质基础,特别是麻疯树抗植物病原真菌的物质基础,我们对麻疯树几丁质酶的基本性质进行了研究。用不同pH值(pH4~9)的提取缓冲液分别提取麻疯树种子中的几丁质酶,检测并比较其酶活性,从而优化麻疯树几丁质酶的提取条件。将在最适pH的缓冲液中提取所得的几丁质酶粗提液与反应底物(胶体几丁质)在不同反应温度(30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃)、不同反应时间(10min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min)下进行反应以测定其酶活性。结果表明,在麻疯树种子中有几丁质酶的存在,并且在提取缓冲液pH为7.0时,所得的几丁质酶粗提液活性最高;通过对麻疯树几丁质酶作用的时间、作用温度等条件的分析发现:麻疯树几丁质酶粗提液在温度为55℃时,与底物胶体几丁质作用60min后,可最大效率地降解几丁质。同时,本实验还比较了麻疯树不同组织中几丁质酶的比活性,结果表明:从麻疯树幼苗的根、茎、叶中都发现有几丁质酶活性的物质的存在。但比活性大小存在差异,具体表现在:叶>茎>根。为进一步研究利用麻疯树资源奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 魏琴,赖家业,周锦霞,戎芳,徐莺,唐琳,陈放;干旱胁迫下麻疯树毒蛋白的Western杂交分析[J];北京林业大学学报;2004年05期
2 戎芳,王胜华,赵小光,郭亮,魏琴,唐琳,徐莺,陈放;麻疯树外植体愈伤组织中毒蛋白的Western-blot鉴定[J];四川大学学报(自然科学版);2005年01期
3 黄东宏,邱巍,傅珠玑,叶晓明,潘克桢;肥皂草毒蛋白的纯化、性质及晶体生长研究[J];生物化学与生物物理学报;1995年03期
4 林锦梅;龚守芳;鄂顺梅;黄运洪;赖坤;朱海燕;赵远波;侯永辉;邹江英;;人热激因子-1突变体hHSF190/2在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及其活性研究[J];生物技术通讯;2008年04期
5 蒋荣庆,娄艳春,刘望夷;樟树种子核糖体失活蛋白的初步研究[J];生物化学与生物物理进展;1990年02期
6 裴武红,王润华,郑硕,沈倍奋;重组蓖麻毒素A链与几种天然单链核糖体失活蛋白的活性研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年01期
7 哈小琴,王新国,吴祖泽;人肝细胞生长因子基因表达质粒的构建及其活性研究[J];中国应用生理学杂志;2002年03期
8 魏明卉,李英,刘征;核糖体失活蛋白及研究进展[J];南都学坛;2001年06期
9 林娟,陈钰,徐莺,颜钫,唐琳,陈放;麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达(英文)[J];Acta Botanica Sinica;2003年07期
10 曾礼华,严钫,陈放;麻疯树叶提取物对鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用[J];中国家禽;2004年S1期
11 林娟,唐琳,陈放;麻疯树的组织培养及植株再生[J];植物生理学通讯;2002年03期
12 陈钰,魏琴,唐琳,陈放;麻疯树营养器官和种子的蛋白质组成及对水分和温度胁迫的反应[J];中国油料作物学报;2003年04期
13 董熇;刘望夷;;核糖体失活蛋白—RNA N-糖苷酶[J];细胞生物学杂志;1990年02期
14 孙红;万忠海;张国利;吴广谋;朱平;岳玉环;;抗人ICAM-1单链抗体表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达[J];中国生物制品学杂志;2008年05期
15 魏琴,陆伟达,廖毅,潘树林,徐莺,唐琳,陈放;从麻疯树上胚轴外植体再生植株(英文)[J];植物生理与分子生物学学报;2004年04期
16 郑硕;;植物毒蛋白[J];生物化学与生物物理进展;1987年04期
17 陈红,王悦,颜茂恭,余明琨,姚启智;天花粉蛋白等五种核糖体失活蛋白的5′-AMP-磷酸酯酶活性[J];中国生物化学与分子生物学报;1996年02期
18 杨元德,周康靖,潘克桢,张蓉真,陈儒明,饶平凡;肥皂草毒蛋白分离纯化及性质研究[J];生物化学与生物物理进展;2000年01期
19 郭德军;柳增善;潘风光;;重组靶向毒素IL-6(23)-PE40_(KDEL)在毕赤酵母中的表达及其活性[J];中国生物制品学杂志;2008年06期
20 周倩;高必达;;真核生物对核糖体失活蛋白的抗感机制[J];中国农学通报;2010年15期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 秦小波;徐莺;唐琳;陈放;;麻疯树胁迫诱导核糖体失活蛋白curcin—L启动子分析和转基因鉴定[A];2009中国植物学会植物细胞生物学学术年会论文摘要集[C];2009年
2 杨松全;曹国文;付利芝;杨睿;杨柳;杨金龙;;核糖体失活蛋白的研究进展[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(上册)[C];2010年
3 王迎春;徐莺;陈放;;麻疯树油体脂肪酶基因的克隆和鉴定[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
4 陈玉飞;祁克宗;彭开松;涂健;;鸡β-防御素-8 cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
5 张锦秀;晁生玉;史利军;候绍华;李刚;;猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
6 廖富蘋;钟杨生;邓平建;黄自然;刘建军;房师松;赵锦;;转抗菌肽基因辣椒的表达产物的检测[A];中国蚕学会第四届青年学术研讨会会议论文集[C];2004年
7 党志胜;殷宏;罗建勋;关贵全;马米玲;刘志杰;王艳华;刘爱红;杨东英;蒋锡仕;;环形泰勒虫裂殖体表面蛋白(TaSP)基因高免疫原性区的克隆及其在大肠杆菌中的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
8 尹继刚;张西臣;李建华;刘晓枫;李德昌;;抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40重组毒素的可溶性表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
9 骆学农;郑亚东;窦永喜;景志忠;才学鹏;;猪带绦虫六钩蚴45W-4B基因的克隆和表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
10 黄宇烽;朱国华;陈德宇;;抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链的真核表达[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 罗孟军;麻疯树毒蛋白curcin的表达、纯化、复性及体外活性和几丁质酶性质的研究[D];四川大学;2006年
2 林娟;麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白(curcin)的分离纯化、基因克隆及作用机理研究[D];四川大学;2002年
3 张婕;嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
4 咸洪泉;菌寄生真菌几丁质酶基因的克隆及功能研究[D];山东农业大学;2011年
5 刘改枝;新型多取代丁烯内酯的设计、合成及生物活性研究[D];郑州大学;2010年
6 赵玉;美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及叶片中抗病毒蛋白的分离[D];中国农业大学;2004年
7 魏琴;麻疯树(Jatropha curcas)种子抗真菌蛋白及相关基因的分离、表达研究[D];四川大学;2004年
8 刘仁水;几种核糖体失活蛋白的分离纯化、性质、生理功能及分布的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2002年
9 徐洪;核糖体失活蛋白的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
10 李丰;丝瓜籽和栝楼籽中的小分子核糖体失活蛋白(肽)的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邓骛远;麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白curcin2基因的原核表达[D];四川大学;2006年
2 戎芳;麻疯树(Jatropha curcas L.)外植体愈伤组织中毒蛋白(curcin)Western-blot鉴定及其烟草转基因研究[D];四川大学;2004年
3 孙晴;麻疯树(Jatropha curcas)的RAPD分析与麻疯树毒蛋白在大肠杆菌中的表达[D];四川大学;2002年
4 谢树章;蜡梅(Chimonanthus praecox (L.)Link)几丁质酶基因Cpchia的克隆及原核表达产物特性分析[D];西南大学;2009年
5 孙炳欣;人参CLASSⅢ几丁质酶基因克隆、序列分析及原核表达[D];吉林农业大学;2006年
6 翟逸;莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)产几丁质酶条件及酶活性研究[D];西南大学;2008年
7 陈建酬;蓝鳃太阳鱼的人工繁殖及消化酶活性的研究[D];湖南农业大学;2005年
8 李颖;环境因素对纳米铝粉活性影响规律的研究[D];华中科技大学;2005年
9 赵健;HaSNPV几丁质酶基因原核表达、纯化与复性的研究[D];西北大学;2006年
10 张福丽;小黑杨抗真菌病转基因的研究[D];东北林业大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 洪宝光;麻疯树产业发展论坛在博鳌召开[N];海南日报;2008年
2 蒋艾丽;会理八万亩“生物油田”现雏形[N];凉山日报(汉);2007年
3 吴伟农;美科学家发现配对毒蛋白可能导致疯牛病[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2001年
4 国家林业局 王桂芝;生物能源植物麻疯树初露锋芒[N];中国花卉报;2006年
5 周静;麻疯树将成“摇钱树”[N];凉山日报(汉);2007年
6 蒋艾丽晏文金;会理大力发展麻风树造林初见成效[N];凉山日报(汉);2007年
7 本报记者 张元忠 鲜荣 实习生 伊念;麻疯树炼油机遇几何[N];四川日报;2006年
8 李双民;绿化扶贫路子宽[N];市场报;2006年
9 记者 郭金凤;“云南南天”全面开发麻疯树资源[N];中国花卉报;2006年
10 李欣;麻疯树种子育苗如何操作?[N];中国花卉报;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978